في وقت واحد قبل وبعد متشابك تسجيل الكهربية من

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على مستنبتات أولية من عصبونات النخاع الشوكي والخلايا العضلية المترابطة تشابكياً من أجنة Xenopus. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحفيز التكاثر في Xenopus من خلال حقن الهرمون الغددِي المشيمي البشري (hCG) في كل من الضفادع الذكور والإناث وجمع البيض المخصب. وتتمثل الخطوة الثانية في إزالة الغشاء الهلامي والكيس المحي والأسماك من أجنة المرحلة 22.

بعد ذلك، يتم عزل العصبونات الشوكية والعضلات من الأجنة، ثم تُزال البشرة ويتم التخلص منها. وتتمثل الخطوة النهائية في زرع الخلايا المعزولة في أطباق زراعة خلوية للسماح بتكوين وصلات عصبية عضلية وظيفية. وفي النهاية، يمكن إثبات وجود وصلات مشبكية وظيفية من خلال تسجيلات تثبيت الرقعة المزدوجة والمتزامنة من العصبونات والخلايا العضلية في المزرعة.

تكمن روعة هذه التقنية في أنها توفر تحضيراً مشبكياً للفقاريات يسهل الوصول إليه. ويمكن استخدامها لمراقبة إطلاق النواقل العصبية عبر تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربائية لما بعد المشبك، مع قياس تواجد الأيونات قبل المشبكية في الوقت ذاته. علاوة على ذلك، فإن الطرق واضحة ومباشرة، ولا تتطلب أي معدات خاصة باستثناء مجهر تشريحي، ومن ثم يمكن تخزين المزارع في درجة حرارة الغرفة في وسط زراعي بسيط.

يمكن أن يكون هذا التحضير مفيداً في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الفسيولوجيا المشبكية، بما في ذلك كيفية اقتران الأحداث قبل المشبكية والكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية مع إطلاق الناقل العصبي. بالإضافة إلى ذلك، فإنه مفيد أيضاً لدراسة التعديل العصبي وتكوين المشابك واللدونة المشبكية. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير المحاليل المطلوبة وفقاً للمخطوطة المرفقة. ثم قم بتصنيع أداتي تشريح دقيق على الأقل عن طريق لصق دبوس "minuchin" في نهاية ماصة باستير زجاجية.

باستخدام غراء سانو الأكريليكي، اسمح للطرف المدبب من الدبوس بالبروز خارج نهاية الماصة بحوالي 0.5 centimeters. قبل يومين من تحضير المزارع، حدد زوجاً من XUS جاهزاً للتزاوج من خلال ملاحظة وجود مخلب aika أحمر بارز لدى الأنثى وتصبغ داكن على السطح المستوي للقوائم الأمامية لدى الذكر. بعد ذلك، اصطد كل ضفدع بالشبكة وثبته بحيث يكون الجانب البطني لأسفل في حوض غسيل مع الشبكة لتمكينه من الهروب.

احقن 1 mL من HCG عبر الشبكة وتحت الجلد في أحد الأكياس اللمفاوية الظهرية لضمان عدم قيام الحيوانات بدهس البيض المخصب الذي تم وضعه حديثاً. قم بتركيب أرضية مصفاة بحجم فتحات يبلغ نصف بوصة، بحيث يتم تثبيتها على ارتفاع يتراوح من بوصة إلى بوصتين عند قاع الحوض. بعد ذلك، ضع زوج التكاثر معاً في حوض مياه مغطى بسعة 10 غالون.

اترك الضفادع دون إزعاج لمدة تتراوح من 12 إلى 48 ساعة حتى تُلاحظ وجود بيوض مخصبة على الأرضية أسفل الغربال. بعد ذلك، قم بإخراج الحيوانات من الحوض، ولكن اترك البيوض دون إزعاج لمدة 24 ساعة إضافية على الأقل. ويمكن إعادة تزاوج هذا الزوج من الضفادع بعد ستة أسابيع.

بعد ذلك، قم بتحرير الأجنة من قاع الحوض وانقلها إلى أربعة أو خمسة أطباق زراعة بمقاس 60 × 15 مليمتر تحتوي على محلول ملحي بتركيز 10%. قم بفرز الأجنة حسب المرحلة وفقاً لمخطط new coupe وFaber؛ وتعتبر الأجنة ذات المظهر الناعم مع تلوين بني وأبيض فاتح مثل تلك الموجودة على اليسار مثالية. ومن ناحية أخرى، فإن الأجنة التي تحتوي على بقع سوداء أو بيضاء كبيرة مثل تلك الموجودة على اليمين تكون غير صحية بشكل عام وغير صالحة للاستخدام.

داخل غطاء التدفق الصفائحي، قم بتسمئة وملء أطباق زراعة معقمة مقاس 360 × 15 مليمتر حتى المنتصف تقريباً بـ 10%saline، وطبق واحد بـ CMF. باستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة، انقل من خمسة إلى 10 أجنة في المرحلة 22 إلى 24 إلى أحد الأطباق التي تحتوي على 10%saline. وبمساعدة مجهر تشريح زووم ستيريو داخل الغطاء، قم بإزالة الغشاء الهلامي والغشاء الخارجي من كل جنين باستخدام زوجين من الملاقط المعقمة. اغسل الأجنة العارية بتمريرها فرادى عبر الطبقين المتبقيين من 10%saline، وأخيراً في الطبق الذي يحتوي على CMF.

بعد ذلك، أمسك كل جنين برفق ولكن بإحكام باستخدام ملقط، واستخدم أداة التشريح الدقيق لإزالة الأنبوب العصبي والقطع العضلية المرتبطة به، والتي تقع في الجانب الظهري الأقصى من الحيوان. قم بذلك عن طريق إجراء ثلاثة شقوق، شق عند كل طرف من طرفي موقع الأنبوب العصبي، وشق ثالث أسفل الجانب البطني منه مباشرة. ثم انقل كل قطعة من الأنبوب العصبي والقطع العضلية التي تم تشريحها إلى جزء نظيف من الطبق بعيداً عن حبيبات المح، والشوائب الأخرى.

بعد حوالي 15 دقيقة في CMF، استخدم الملقط لرفع الجلد المصبغ بعيداً عن النسيج المُشرح وتخلص من الجلد. بعد 30 إلى 60 دقيقة إضافية، ستشكل الخلايا كومة رملية بينما تنفصل عن بعضها البعض. في هذا الإجراء، قم بإذابة أنبوب سعة 10 milliliter من وسط الزراعة، ثم أضف 70 microliters من ITS بتركيز 35 nanograms per milliliter، وعلامة BDNF واملأ أطباق الزراعة المعقمة سعة 35 millimeter إلى منتصفها تقريباً بوسط الزراعة L 15.

استخدم طبق زراعة واحدًا لكل جنين قمت بتشريحه. ولصنع ماصة توزيع، أمسك طرفي ماصة باستير زجاجية وضع الجزء المستدق فوق لهب، ثم اسحب الطرفين بعيدًا عن بعضهما لمسافة 10 centimeters تقريبًا.

بعد ذلك، اكسر الطرف للحصول على سن يبلغ طوله 0.2 مليمتر تقريباً. ثم استخدم ماصة التلقيح لسحب كومة الرمل من جنين واحد. احرص على تقليل كمية المحلول المسحوبة إلى أدنى حد.

بعد ذلك، قم بتفريغ الخلايا على قاع طبق زراعة ووزعها في عدة خطوط. ثم اترك أطباق الخلايا الموزعة دون تحريك لمدة 15 دقيقة على الأقل لمنح الخلايا وقتاً للالتصاق بالطبق. وبعد مرور 12 إلى 24 ساعة في المزرعة، ستطور الخلايا الموزعة خصائص مورفولوجية متميزة.

على سبيل المثال، تصبح الخلايا العضلية مغزلية الشكل وتطور العصبونات الشوكية استطالات طويلة. ويمكن تأكيد الاتصال التشابكي الوظيفي بين التوسع الوريدي والخلايا العضلية من خلال تسجيلات كهرومغناطيسية مزدوجة متزامنة. وللقيام بذلك، قم بتجهيز قطبين للرقعة (patch electrodes) للتسجيل، أحدهما للتوسع الوريدي قبل التشابكي، والآخر للخلية العضلية.

ثم املأ القطب قبل المشبكي بمحلول يحتوي على info terin، والقطب بعد المشبكي بمحلول بوتاسيوم داخلي. بعد ذلك، استبدل الوسط في طبق الزراعة بـ NFR. ثم انقل الطبق إلى مجهر مقلوب مجهز ببصريات تباين الطور، وقم بإجراء تثبيت الرقعة (patch) للتوسع قبل المشبكي باستخدام القطب الذي يحتوي على الأمفوتيريسين، ولخلية العضلات بعد المشبكية باستخدام القطب الآخر للتأكد من كفاءة عمل المشبك، ثم قم بإزالة استقطاب التوسع باستخدام مضخم تثبيت الرقعة (patch clamp amplifier)، وراقب التيارات قبل المشبكية وبعد المشبكية بشكل متزامن.

يظهر هذا الشكل عرضاً بتكبير 5x للخلايا والمزرعة مباشرة بعد الزرع، وهذه هي المزرعة نفسها بتكبير 40x. وهنا يظهر الوصل العصبي العضلي في المزرعة، والذي يوضح جسم العصبون، والطرف قبل المشبكي، والتوسع الوريدي، والخلية العضلية بعد المشبكية. وموضح هنا التيارات قبل المشبكية وبعد المشبكية.

استجابةً لتطبيق خطوات جهد تدريجية بمقدار 10 millivolt تم تقديمها إلى التوسع قبل المشبكي من -30 millivolt إلى +40 millivolt، كان جهد التثبيت لكلتا الخليتين -70 millivolt. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون ساعتين تقريباً. ويمكن بعد ذلك الحصول على مستنبتات خلوية قابلة للحياة في غضون 24 ساعة، ويمكن الحفاظ عليها لعدة أيام. وقد استُخدم هذا التحضير لعدة سنوات، مما ساعد في تفسير بعض الخصائص الأساسية للنقل العصبي العضلي.

نأمل أن يساهم هذا الفيديو في استمرار عملية الاكتشاف من خلال مساعدة الباحثين على أن يصبحوا أكثر دراية بهذه التقنية القوية والبسيطة.