عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية الحصول على صور عالية الجودة للعاصفة فائقة الدقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد عينة اختبار مصنفة بالفلورسنت أولا. الخطوة الثانية هي إعداد المخزن المؤقت للتبديل ثم ملء غرفة التصوير بالمخزن المؤقت.

بعد ذلك ، يتم الحصول على البيانات الأولية على مجهر العاصفة. الخطوة الأخيرة هي إعادة بناء الصور فائقة الدقة من البيانات الأولية باستخدام برنامج معالجة العواصف الممطرة. في النهاية ، يتم استخدام عينات الاختبار لإظهار كيفية الحصول على بيانات أولية عالية الجودة ، والتي يمكن معالجتها بعد ذلك لإنشاء صور فائقة الدقة للعاصفة في خلايا بدقة تتراوح بين 30 و 50 نانومتر ، مما يمثل تحسينا للدقة من خمسة إلى عشرة أضعاف مقارنة بتقنيات الفحص المجهري الفلوري التقليدية بما في ذلك العشب والكونفوكالي.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنهم لا يدركون أهمية جمع الكثير من الروابط المتناثرة عالية الجودة. أصبح هذا أسهل بكثير باستخدام صبغة Alexa 6 4 7 في المخزن المؤقت للتبديل الصحيح. يعد العرض المرئي لهذه التقنية أمرا ضروريا لأن الحصول على بيانات أولية عالية الجودة أمر بالغ الأهمية في إنتاج صور بدقة SPR.

تبدو تسلسلات الفيديو الأولية لهذه التقنية مختلفة تماما عن أي شكل آخر من أشكال الفحص المجهري الفلوري. لبدء إجراء طلاء الزجاج بالدكسترين الفلوري عند 200 ميكرولتر من محلول البولي ليسين 0.01٪ لكل بئر من زجاج مكون من ثماني غرف واحتضانه لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، قم بإزالة محلول البولي ليسين باستخدام ماصة للتأكد من عدم وجود سائل مخفف.

0.25 ميكرولتر من محلول مخزون ملليغرام لكل مليلتر من الدكسترين. Alexa 6 47 في 25 ميكرولترا من الماء منزوع الأيونات لإنشاء محلول 20 ميكروغرام لكل مليلتر لإنشاء طلاء عالي الكثافة من الدكسترين. حل Alexa 6 47.

خفف 20 ميكرولترا من محلول 20 ميكروغرام لكل مليلتر إلى ما مجموعه 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. للحصول على محلول متوسط الكثافة ، قم بتخفيف ميكرولترين في 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. لحل منخفض الكثافة ، قم بتخفيف 0.2 ميكرولتر.

في 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات ، أضف 200 ميكرولتر من محاليل الدكسترين المخفف Alexis X 47 لكل بئر واحتضنه لمدة 10 دقائق. يمكن استخدام أوقات حضانة أطول ، مما قد يؤدي إلى طلاء دكسترين أكثر كثافة. أخيرا ، قم بإزالة محاليل Dexter Xis X 47 واغسلها بالماء ثلاث مرات.

لتحضير خيوط الأكتين الفلورية على الزجاج أولا ، أضف 200 ميكرولتر من محلول البولي ليسين 0.01٪ إلى كل بئر من ثماني غرفة. غطي الزجاج واحتضنه لمدة 10 دقائق. قم بإزالته باستخدام ماصة للتأكد من عدم وجود سائل.

أضف إلى كل غرفة 90 ميكرولترا من عازلة الأكتين العامة التي أعيد تكوينها مسبقا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم أضف 10 ميكرولتر من محلول خيوط الأكتين المشكل مسبقا 10 ميكرومولار وميكرولتر واحد من فويد الميكرولتر و Alexa 6 47 وقم بسحب الأنابيب برفق لأعلى ولأسفل للخلط ، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتحضير حبات الفلورسنت المجهرية كعلامات إيمانية لتخفيف ميكرولتر واحد من حبات التيبك إلى 200 ميكرولتر PBS وخلطها. أضف الخرزات المخففة إلى غرفة التصوير وانتظر لمدة 15 دقيقة.

بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة المحلول وغسله ثلاث مرات باستخدام PBS قبل التصوير ، يتم استخدام الخلايا المزروعة إلى ما يقرب من 80٪ من الطلاقة المشتركة في هذه التجربة. قم بإزالة وسط الثقافة واغسله باستخدام PBS. ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد بنسبة 4٪ لمدة 10 دقائق.

قم بإزالة الفورمالديهايد واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS. لا تسمح للخلايا بالبقاء جافة واستخدم دائما محاليل PBS المخزنة. لتجنب الإجهاد المنخفض التوتر ، أضف ميكرولترين من محلول مخزون 50 ميكروغرام لكل مليلتر من EGF Alexa ، 6 47 إلى 200 ميكرولتر من محلول BSA 0.1٪ ، ثم أضف هذا المحلول إلى خلايا hela.

احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المحلول واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS. أضف محلول مانع بنسبة 0.1٪ BSA واتركه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الحظر واغسله ثلاث مرات أخرى باستخدام PBS قبل التصوير. قبل التصوير مباشرة ، قم بإعداد المخزن المؤقت للتبديل عن طريق خلط إنزيم الجلوكوز وتقليل محاليل مخزون العامل معا بنسبة 50 ميكرولتر و 400 ميكرولتر و 100 ميكرولتر ، أضف PBS لتكوين الحجم النهائي إلى مليلتر واحد. قم بإزالة PBS من غرفة التصوير ثم املأها إلى الأعلى بمخزن التبديل.

ضع زلة غطاء بعناية فوق الجزء العلوي من الغرفة ، مع التأكد من عدم وجود فقاعات على الإطلاق وتغطية الغرفة بأكملها. إذا شوهدت أي فقاعات ، فقم بتعبئتها بمخزن مؤقت إضافي أو PBS. وإلا، يمكن أن ينخفض أداء المخزن المؤقت.

جمع بيانات الربط عالية الجودة والمتناثرة أمرا ضروريا لنجاح هذا الإجراء ، لذا تأكد من تركيز المجاهر بشكل صحيح واستخدام إعدادات الاستحواذ الصحيحة. حدد موقع هيكل الفلورسنت المراد تصويره. حدد زاوية الإضاءة المطلوبة.

في هذه الحالة ، يوصى باستخدام العشب أو الزاوية المائلة للغاية لأن هذا يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء عن طريق تقليل الضوء خارج التركيز ، وهو أمر مفيد بشكل خاص لعينات الخلايا. خذ إشارة إلى صورة محدودة الكسر للهيكل قبل تصوير العاصفة. قم بزيادة ليزر الإثارة إلى طاقة عالية تتوافق مع ما يقرب من كيلوواط لكل سنتيمتر مربع أثناء التصوير باستخدام إعدادات الكاميرا من 10 مللي ثانية ووقت دورة يبلغ حوالي 50 هرتز أو إطارا في الثانية.

بمجرد أن تنتقل النباتات الأربعة إلى نمط وميض متناثر ، اجمع 10،000 إطار. لبدء إعادة الإعمار هذه. افتح ملف RAINSTORM M من داخل MATLAB وقم بتشغيله في نافذة العاصفة الممطرة.

حدد ملف الصورة المراد تحليله باستخدام زر الاستعراض. يجب أن يكون هذا ملف TIF. قم بتغيير عرض البكسل لمطابقة البيانات الأولية لنظام المجهر المستخدم للحصول على البيانات.

اترك القيم الأخرى افتراضيا. اضغط على زر معالجة الصور وانتظر حتى تظهر صورة أولية. ستعتمد مدة المعالجة على حجم الملف ومواصفات الكمبيوتر وعدد الروابط المرشحة داخل البيانات الأولية.

لإنشاء صورة فائقة الدقة محدثة ، اضغط على زر فتح المراجع وستظهر نافذة ثانية. اضغط على زر ضبط التباين لتغيير عرض الصورة حسب الرغبة. في بعض الحالات التي تكون فيها الصورة مظلمة جدا ، يجب تقليل القيمة القصوى.

استخدم نافذة المراجع لإنشاء مقاييس مفيدة لجودة الصورة وتحسين الصورة فائقة الدقة بشكل أكبر. اترك معلمات مراقبة الجودة الثلاثة الأولى للقيم الافتراضية من 5 و 000 0.1 و 0.8 إلى 3.5 على التوالي. قم بتحديث الأعداد لكل قيمة فوتون.

قم بتغيير قطع دقة التوطين للمقايضة بين تحسين متوسط التوطين والدقة مقابل رقم التوطين. في الصورة النهائية ، يوصى بقيم من 30 إلى 50 نانومتر اعتمادا على جودة البيانات والعينة. عامل مقياس إعادة البناء الافتراضي هو خمسة ، والذي سيولد وحدات بكسل فائقة الدقة تبلغ 32 نانومتر ، بافتراض أن البكسل داخل الصور الأصلية هو 160 نانومتر.

إذا كان حجم بكسل الصور الأولية 100 نانومتر ، فسينتج عن ذلك صور فائقة الدقة بوحدات بكسل تبلغ 20 نانومتر. قم بزيادة عامل المقياس لإنتاج وحدات بكسل فائقة الدقة أصغر. في الصورة النهائية، اضغط على زر تشغيل المراجع لإنشاء صورة فائقة الدقة محدثة.

اضغط على زر عرض الرسوم البيانية لعرض مقاييس جودة الصورة. أخيرا ، اضغط على زر حفظ الصورة في المراجع لحفظ كل هذه البيانات. ابدأ هذا الإجراء عن طريق إنشاء صورة بنفس الطريقة الموضحة سابقا.

اضغط على زر تتبع المربع في المراجع وانقر فوق مربع واسحبه فوق العلامة الإيمانية على الصورة التي تمت مراجعتها. انتظر حتى تظهر صورة جديدة ، والتي ستعرض المواضع المعبأة. احفظ هذه الصورة إذا رغبت في ذلك ، إذا كان الهدف محل الاهتمام هو علامة ائتمانية.

كما هو الحال هنا ، قم بإجراء تصحيح الانجراف بالنقر فوق زر الربط المتبوعا بزر الانجراف الطرح. أخيرا ، انقر فوق تشغيل المراجع مرة أخرى لإنشاء صورة عاصفة جديدة. يجب أن ينتج الطلاء الناجح للدكسترين طبقة أحادية الفلورسنت وبيانات الدكسترين النموذجية موضحة في هذا الشكل.

تظهر الصور المحدودة للحيود تركيزات مختلفة من الدكسترين قبل تصوير العواصف. يبلغ حجم عمليات إعادة البناء فائقة الدقة 25 نانومتر. تم جمع 10,000 صورة بحجم إطار 1 28 × 1 28 بكسل وتظهر إطارات فردية من هذا التسلسل.

بتركيز دكسترين عال. يجب أن تظهر الطبقة الأحادية الفلورية موحدة نسبيا كما هو موضح في هذه الصور ومقطع الفيديو هذا. عند التركيزات المنخفضة ، ستظهر الوميضات أكثر تناثر وفي بؤرة التركيز.

مع عدم وجود خلفية واضحة خلال مرحلة الحصول على الصورة هذه عند إضاءة الليزر المستمرة ، سينخفض عدد الوميضات بمرور الوقت كما هو موضح في المقارنة بين الإطار 2000 والإطار 8 ، 000 في العينة عالية الكثافة. يتمثل الاختلاف الرئيسي بين الصور فائقة الدقة لتركيزات الدكسترين العالية والمتوسطة والمنخفضة في تناقص عدد التوطين. يبين هذا الرسم البياني ما معدله ثلاثة تتابعات رتيل 10,000 لكل تركيز من تركيزات الدكسترين حيث تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري.

ومع ذلك ، فإن هذه العلاقة النسبية بين تركيز جزيئات الفلورسنت وعدد الوميضات في البيانات الأولية وعدد التوطين ليست علاقة خطية بسيطة كما هو موضح في هذا المخطط لعدد التوطين المقبول لكل إطار. باستخدام متوسط 100 إطار متدحرج عند كثافة جزيئية عالية جدا ، يتعذر على البرنامج توطين الجزيئات بنجاح عند تصوير أي عينة. يمكن أن تكون المشكلة الشائعة هي وجود ضباب فلوري ساطع ولكن غير مركز عبر الصورة الناجم عن انتشار قوة الفلورو عبر الوسط.

يمكن منع جزيئات الفلورسنت المنفصلة هذه أو إزالتها عن طريق زيادة عدد خطوات الغسيل باستخدام PBS قبل إضافة المخزن المؤقت للتبديل أو عن طريق إضافة مخزن مؤقت جديد للتبديل إلى معالجة الغرفة ومقارنة البيانات من كل تسلسل صورة ينتج عنه صور فائقة الدقة مختلفة جدا. اللوحة C و D عبارة عن إنشاءات صور فائقة الدقة تتوافق مع البيانات التي تم جمعها في اللوحتين A و B على التوالي. يرسم هذا الرسم البياني عدد التوطين المقبول لكل إطار باستخدام متوسط إطار 100 متدحرج.

يتوافق الخط الأحمر مع تسلسل العاصفة A و C حيث توجد خلفية عالية ، والخط الأزرق يتوافق مع B و D حيث تكون الخلفية منخفضة. يظهر رقم الترجمة المقبول للصور المقابلة لبيانات الخلفية العالية والمنخفضة في الرسم البياني الثاني. تظهر هذه الصور الثلاث المحدودة الحيود بيانات نموذجية لخيوط الأكتين مسبقة التشكيل الملتصقة بسطح الزجاج قبل إضافة عازلة التبديل وتصوير العواصف.

يمكن رؤية أطوال متغيرة من الخيوط. غالبا ما تكون الخيوط الساطعة جدا عدة خيوط متشابكة معا. يؤدي اختيار خيوط مفردة ساطعة نسبيا بدلا من المناطق المتشابكة إلى الحصول على صور ذات جودة أفضل أثناء مرحلة الاستحواذ.

يجب رؤية وميض ساطع في التركيز على طول الفتيل. يجب رؤية وميض متناثر أثناء مرحلة الاقتناء وبعد ذلك في بيانات العملية. يجب أن يكون هناك خيوط مستمرة رفيعة في التوطين لكل إطار يجب أن تظهر انخفاضا تدريجيا.

عادة ما يتم إعطاء الكامل بنصف الحد الأقصى أو FWHM للخيوط كتقدير تجريبي للدقة عن طريق رسم خط مستقيم من خلال منطقة مكبرة من خيوط الأكتين باستخدام ميزة ملف تعريف المؤامرة في الصورة J وبعد ذلك إجراء ملاءمة غاوسية. يتم حساب FWHM على أنه 43.2 نانومتر. يمكن أن تحدث مشكلة توطين خاطئة عندما يتفرع عدد من خيوط الأكتين أو يتقاطع مع بعضها البعض عن طريق معالجة مجموعات فرعية من الإطارات ومقارنة أول وآخر 5000 إطار.

يتم إنتاج صورة مختلفة في الصورة فائقة الدقة باستخدام أول 5000 إطار. تظهر العديد من التوطين في منتصف الصورة. ومع ذلك ، عند استخدام آخر 5000 إطار ، يظهر عدد قليل جدا من هذه التوطين ويتم ترك الخيوط فقط وإن كانت مستمرة إلى حد ما بسبب قلة عدد التوطين في الصورة.

إذا كان هناك اشتباه في كثافة وميض عالية جدا، فإن مقارنة الصور مع بيانات الترجمة لكل إطار يمكن أن توحي بقوة بأن هذه المشكلة تحدث أثناء المجموعة الأولى من الإطارات. يوجد متوسط عدد من التوطين لكل إطار يزيد عن 10 مقارنة بالمجموعة الأخيرة من الإطارات حيث تبلغ حوالي أربعة. مشكلة أخرى محتملة في الفحص المجهري للعاصفة هي الانجراف ، والذي يحدث عندما تتحرك العينة فيما يتعلق بالعدسة الموضوعية من خلال مرحلة الحصول على البيانات ، على الرغم من صعوبة اكتشافها أثناء مرحلة الحصول على الصورة ، يمكن اكتشاف الانجراف في الصور فائقة الدقة للهياكل المعروفة مثل خيوط الأكتين.

أول علامة على احتمال حدوث الانجراف الجانبي هي أن الهيكل أكبر من المتوقع. مثلا ، مع كاملة كبيرة نسبيا مع نصف حد أقصى مقارنة مع بيانات حد الدقة من عاصفة مطيرة ، في هذه الحالة 90 نانومتر مقارنة ب 67 نانومتر. أفضل طريقة لاكتشاف الانجراف هي مقارنة التوطين كدالة للوقت IE ، ومعرفة ما إذا كانت التوطين في الإطارات اللاحقة قد تم إزاحتها مقارنة بتلك الموجودة في الإطارات المبكرة.

يمكن ملاحظة ذلك بوضوح في حالة خيوط الأكتين عند عرضها برمز لون. باستخدام ميزة تتبع الصندوق في العواصف الممطرة كما هو موضح في اللوحي B و c يتم عرض التوطين بلون يتوافق مع رقم الإطار وقت الحصول عليها. على سبيل المثال، تكون عمليات التوطين من وقت مبكر في تسلسل الاستحواذ باللون الأزرق بينما تكون عمليات التوطين من أواخر تسلسل الاستحواذ حمراء.

تشير الألوان النازحة إلى حدوث الانجراف من أجل القياس والتصحيح. بالنسبة للحبات الفلورية الانجرافية التي يبلغ قطرها 100 نانومتر ، يمكن استخدامها كعلامات إيمانية ، تظهر الأرقام من واحد إلى أربعة حبات مقصوصة ومكبرة بشكل فردي. في مثال حيث يوجد انجراف شديد نسبيا يبلغ حوالي 100 نانومتر على مدار ثلاث دقائق و 10 ثوان خلال مرحلة الاستحواذ ، يمكن استخدام نفس ميزة تتبع الصندوق لتلوين التعليمات البرمجية وتأكيد حدوث الانجراف حيث تظهر جميع الخرزات الأربعة في هذا المثال بالقرب من الانجراف المتطابق ، من الممكن تحديد أحدها في هذه الحالة حبة اثنان لاستخدامها كمرجع وطرح الانجراف من الخرز الأخرى.

وتبين المقارنة مع اللوحة E أن الانجراف الجانبي قد تصحيح. أخيرا ، يمكن استخدام خلايا الكعب الملطخة بعامل نمو البشرة لإعطاء مثال واقعي لدقة الصورة. في اللوحة A للخلايا ، تظهر صورة محدودة الانعراج لجزء من خلية hela مركزة على سطح الخلية القاعدية حيث تشير المربعات الصفراء إلى التكبير في مناطق الاهتمام الموضحة في اللوحين B و C على عكس التكبير غير الواضح في مناطق الاهتمام في الصورة المحدودة للحيود.

يجب أن تظهر الصور فائقة الدقة مزيجا من المجموعات المعزولة في بعض الأحيان وحدات البكسل المفردة. سيكون قطر العناقيد حوالي 100 نانومتر ومن المحتمل أن تتوافق مع تشكيل الحفر والحويصلات. يتم عرض المسار الذي يتم من خلاله في الغالب تقليل تنظيم EGF وتوطين الخلايا الداخلية لكل بيانات إطار من اللوحة D في الرسم البياني G.بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عمل بعض عينات الاختبار البسيطة ، والحصول على البيانات وإعادة بناء عاصفة عالية الجودة ، انظر صور الدقة.

ستساعد هذه الطرق في تجنب بعض المزالق الشائعة مثل الانجراف ، وتساعد في تحسين عاصفتك. انظر تجارب الدقة.