عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية الحصول على صور عالية الجودة بتقنية الدقة الفائقة STORM. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير عينة اختبار موسومة فلوروسنتياً. والخطوة الثانية هي تحضير محلول التبديل المنظم (switching buffer) ثم ملء غرفة التصوير بهذا المحلول.

بعد ذلك، يتم الحصول على البيانات الخام باستخدام مجهر STORM. وتتمثل الخطوة النهائية في إعادة بناء صور فائقة الدقة من البيانات الخام باستخدام برنامج معالجة RainStorm. وفي نهاية المطاف، تُستخدم العينات المختبرة لتوضيح كيفية الحصول على بيانات خام عالية الجودة، والتي يمكن معالجتها لاحقاً لإنتاج صور STORM فائقة الدقة في الخلايا بدقة تتراوح بين 30 و 50 نانومتر، وهو ما يمثل تحسناً في الدقة بمقدار خمس إلى عشر مرات مقارنة بتقنيات المجهر الفلوري التقليدية، بما في ذلك TIRF والمجهر البؤري.

بشكل عام، يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبات لأنهم لا يدركون أهمية جمع الكثير من الروابط المتفرقة عالية الجودة. ويصبح هذا الأمر أسهل بكثير باستخدام صبغة Alexa 6 4 7 في محلول التبديل المناسب. ويعد العرض المرئي لهذه التقنية أمراً ضرورياً لأن الحصول على بيانات خام عالية الجودة يعد أمراً حاسماً في إنتاج صور ذات دقة SPR.

تبدو تسلسلات الفيديو الخام لهذه التقنية مختلفة تماماً عن أي شكل آخر من أشكال المجهر الفلوري. لبدء إجراء طلاء الزجاج بالديكسترين الفلوري، يُضاف 200 µL من محلول polylysine بتركيز 0.01% إلى كل بئر من زجاج غطاء ذي ثماني غرف ويُحضن لمدة 10 دقائق. بعد مرور 10 دقائق، يُزال محلول polylysine باستخدام ماصة لضمان عدم بقاء أي سائل مخفف.

أضف 0.25 µL من محلول مخزون من dextrin Alexa 647 بتركيز 2 mg/mL إلى 25 µL من الماء منزوع الأيونات لتحضير محلول بتركيز 20 µg/mL، وذلك لإنشاء طلاء عالي الكثافة من محلول dextrin Alexa 647.

قم بتخفيف 20 µL من المحلول بتركيز 20 µg/mL في إجمالي 200 µL من الماء منزوع الأيونات. وللحصول على محلول متوسط الكثافة، خفف 2 µL في 200 µL من الماء منزوع الأيونات. وللحصول على محلول منخفض الكثافة، خفف 0.2 µL.

أضف 200 µL من محاليل الديكسترين Alexis X 47 المخففة إلى كل بئر في 200 µL من الماء منزوع الأيونات، ثم حضنها لمدة 10 دقائق. يمكن استخدام فترات تحضين أطول، مما قد يؤدي إلى الحصول على طبقة ديكسترين أكثر كثافة. وأخيراً، قم بإزالة محاليل Dexter Xis X 47 واغسل بالماء ثلاث مرات.

لتحضير خيوط الأكتين الفلورية على الزجاج أولاً، أضف 200 µL من محلول polylysine بتركيز 0.01% إلى كل بئر من غرف الثماني. غطِّ الزجاج واتركه في الحاضنة لمدة 10 دقائق. قم بإزالة السائل باستخدام الماصة للتأكد من عدم بقاء أي سائل.

أضف إلى كل حجرة 90 µL من منظم الأكتين العام (general actin buffer) الذي تمت إعادة تحضيره مسبقاً وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. ثم أضف 10 µL من محلول خيوط الأكتين مسبقة التكوين بتركيز 10 µM وميكرولتر واحد من Alexa 647، وقم بالماصة برفق صعوداً وهبوطاً للمزج، ثم حضن المزيج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتحضير حبيبات الفلورسنت الكروية الدقيقة كعلامات مرجعية (fiducial markers)؛ ولتخفيف ذلك، قم بتخفيف 1 µL من حبيبات tepec في 200 µL من PBS وامزجهما. أضف الحبيبات المخففة إلى حجرة التصوير وانتظر لمدة 15 دقيقة.

بعد مرور 15 دقيقة، قم بإزالة المحلول واغسل ثلاث مرات باستخدام PBS قبل تصوير الخلايا التي تم استزراعها حتى تصل نسبة تلاقيها إلى 80% تقريبًا في هذه التجربة. قم بإزالة وسط الاستزراع واغسل باستخدام PBS. بعد ذلك، أضف 500 µL من محلول formaldehyde بتركيز 4% لمدة 10 دقائق.

أزل الفورمالديهايد واغسل ثلاث مرات باستخدام PBS. لا تترك الخلايا تجف واستخدم دائماً محاليل PBS المنظمة. ولتجنب الإجهاد ناقص التوتر، أضف 2 µL من محلول مخزون بتركيز 50 µg/mL من EGF Alexa, 647 إلى 200 µL من محلول 0.1% BSA، ثم أضف هذا المحلول إلى خلايا hela.

تُحضن العينة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يُزال المحلول وتُغسل العينة ثلاث مرات باستخدام PBS. يُضاف محلول حجب مكون من 0.1%BSA ويُترك لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بإزالة محلول الحجب واغسل ثلاث مرات إضافية باستخدام PBS قبل التصوير. وقبل التصوير مباشرة، قم بتحضير محلول التبديل عن طريق خلط المحاليل المخزنة من إنزيم الجلوكوز والعامل المختزل معاً بنسبة 50 µL و 400 µL و 100 µL، ثم أضف PBS لاستكمال الحجم النهائي إلى 1 mL. قم بإزالة PBS من غرفة التصوير ثم املأها حتى الأعلى بمحلول التبديل.

ضع غطاء الشريحة بعناية فوق الجزء العلوي من الحجرة، مع التأكد من عدم وجود أي فقاعات على الإطلاق وتغطية الحجرة بالكامل. وفي حال ظهور أي فقاعات، قم بإضافة المزيد من المحلول المنظم أو PBS؛ وإلا فقد تنخفض كفاءة المحلول المنظم.

يعد جمع بيانات ربط متناثرة عالية الجودة أمراً ضرورياً لنجاح هذا الإجراء، لذا تأكد من ضبط تركيز المجاهر بشكل صحيح واستخدام إعدادات الاستحواذ المناسبة. حدد البنية الفلورية المراد تصويرها، ثم اختر زاوية الإضاءة المطلوبة.

في هذه الحالة، يوصى باستخدام زاوية "turf" أو زاوية مائلة بشدة، حيث يؤدي ذلك إلى تحسين نسبة الإشارة إلى الضجيج من خلال تقليل الضوء الخارج عن التركيز، وهو أمر مفيد بشكل خاص لعينات الخلايا. يتم أخذ صورة مرجعية ذات كسور محدودة للهيكل قبل التصوير بتقنية STORM. يتم رفع طاقة ليزر الاستثارة إلى قدرة عالية تعادل تقريباً 2 kW/cm² مع التصوير بإعدادات كاميرا تبلغ 10 ms للتعريض وزمن دورة يبلغ تقريباً 50 Hz أو إطاراً في الثانية.

بمجرد أن تتحول الفلورا فورز (flora fours) إلى نمط وميض متناثر، قم بجمع 10,000 إطار. لبدء عملية إعادة البناء هذه، افتح ملف RAINSTORM M من داخل برنامج MATLAB وقم بتشغيله في نافذة rainstorm.

اختر ملف الصورة المراد تحليلها باستخدام زر التصفح. يجب أن يكون الملف بتنسيق TIF. قم بتغيير عرض البكسل ليتطابق مع البيانات الخام لنظام المجهر المستخدم في الحصول على البيانات.

اترك القيم الأخرى على وضعها الافتراضي. اضغط على زر معالجة الصور (process images) وانتظر حتى تظهر صورة أولية. ستعتمد مدة المعالجة على حجم الملف ومواصفات الكمبيوتر وعدد الروابط المرشحة ضمن البيانات الخام.

لإنشاء صورة دقة فائقة محدثة، اضغط على زر فتح المراجع (open reviewer) وستظهر نافذة ثانية. اضغط على زر ضبط التباين (adjust contrast) لتغيير عرض الصورة حسب الرغبة. وفي بعض الحالات التي تكون فيها الصورة مظلمة جدًا، يجب خفض القيمة القصوى.

استخدم نافذة المراجعة لاستخراج مقاييس مفيدة لجودة الصورة وتحسين صورة الدقة الفائقة بشكل أكبر. اترك معاملات ضبط الجودة الثلاثة الأولى على القيم الافتراضية وهي 5,000 و 0.1 و 0.8 إلى 3.5 على التوالي. قم بتحديث قيمة عدد العدات لكل فوتون.

قم بتغيير حد دقة التوطين للمفاضلة بين تحسين متوسط التوطين والدقة مقابل عدد التوطينات. في الصورة النهائية، يوصى بقيم تتراوح من 30 إلى 50 nanometers اعتماداً على جودة البيانات والعينة. عامل مقياس إعادة البناء الافتراضي هو خمسة، وهو ما سينتج بكسلات فائقة الدقة بحجم 32 nanometers، بافتراض أن البكسل في الصور الأصلية هو 160 nanometers.

إذا كان حجم البكسل في الصور الخام 100 nanometers، فسيؤدي ذلك إلى إنتاج صور ذات دقة فائقة ببكسلات حجمها 20 nanometers. قم بزيادة عامل القياس لإنتاج بكسلات ذات دقة فائقة أصغر حجماً. في الصورة النهائية، اضغط على زر run reviewer لإنشاء صورة ذات دقة فائقة محدثة.

اضغط على زر عرض المدرجات التكرارية (view histograms) لعرض مقاييس جودة الصورة. وأخيراً، اضغط على زر حفظ الصورة (save image) في أداة المراجعة لحفظ كل هذه البيانات. ابدأ هذا الإجراء بإنشاء صورة بنفس الطريقة التي تم توضيحها سابقاً.

اضغط على زر تتبع المربع في المراجع، ثم انقر واسحب مربعاً فوق العلامة المرجعية في الصورة التي تمت مراجعتها. انتظر حتى تظهر صورة جديدة تعرض المواضع المحددة بالمربعات. احفظ هذه الصورة إذا رغبت في ذلك، وذلك في حال كان الجسم محل الاهتمام هو علامة مرجعية.

كما هو الحال هنا، قم بإجراء تصحيح الانزياح بالنقر على زر set anchor ثم زر subtract drift. وأخيراً، انقر على run reviewer مرة أخرى لإنشاء صورة STORM جديدة. يجب أن يؤدي الطلاء الناجح بالدكسترين إلى تكوين طبقة أحادية فلورية، وتظهر بيانات الدكسترين النموذجية في هذا الشكل.

تظهر الصور محدودة الحيود تركيزات مختلفة من الديكسترين قبل التصوير بتقنية STORM. تبلغ دقة إعادة البناء فائقة الدقة 25 نانومتر لكل بكسل. تم جمع 10,000 صورة بحجم إطار يبلغ 128 في 128 بكسل، وتظهر إطارات فردية من هذا التسلسل.

عندما يكون تركيز الديكسترين مرتفعاً، يجب أن تظهر الطبقة الأحادية الفلورية موحدة نسبياً كما هو موضح في هذه الصور ومقطع الفيديو هذا. أما عند التركيزات المنخفضة، فستظهر الومضات أكثر تباعداً وأكثر وضوحاً.

مع عدم وجود خلفية واضحة خلال مرحلة الحصول على الصور هذه تحت إضاءة ليزر ثابتة، فإن عدد الومضات سينخفض مع مرور الوقت كما هو موضح من خلال المقارنة بين الإطار 2000 والإطار 8,000 في العينة عالية الكثافة. والفرق الرئيسي بين صور الدقة الفائقة لتركيزات الدكسترين العالية والمتوسطة والمنخفضة هو التناقص في عدد التوطينات. يوضح هذا الرسم البياني متوسط ثلاث تسلسلات مكونة من 10,000 إطار لكل تركيز من الدكسترين، حيث تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري.

ومع ذلك، فإن هذه العلاقة التناسبية بين تركيز الجزيئات الفلورية وعدد الومضات في البيانات الخام وعدد عمليات التحديد الموضعي ليست علاقة خطية بسيطة، كما هو موضح في هذا المخطط لعدد عمليات التحديد الموضعي المقبولة لكل إطار. باستخدام متوسط متحرك لـ 100 إطار عند كثافات جزيئية عالية جدًا، لا يتمكن البرنامج من تحديد مواقع الجزيئات بنجاح عند تصوير أي عينة. ومن المشكلات الشائعة التي قد تحدث هي وجود ضباب فلوري ساطع ولكن غير مركز عبر الصورة، ناتج عن انتشار الفلوروفور عبر الوسط.

يمكن منع أو إزالة هذه الجزيئات الفلورية المنفصلة عن طريق زيادة عدد خطوات الغسل بـ PBS قبل إضافة محلول التبديل، أو عن طريق إضافة محلول تبديل جديد إلى غرفة المعالجة؛ حيث يؤدي مقارنة البيانات من كل تسلسل صوري إلى الحصول على صور فائقة الدقة مختلفة تماماً. يمثل اللوحان C و D تركيبات لصور فائقة الدقة تقابل البيانات التي تم جمعها في اللوحين A و B على التوالي. يوضح هذا الرسم البياني عدد التحديدات الموضعية المقبولة لكل إطار باستخدام متوسط متحرك لـ 100 إطار.

يمثل الخط الأحمر تسلسلي العواصف A وC حيث تكون الخلفية مرتفعة، بينما يمثل الخط الأزرق التسلسلين B وD حيث تكون الخلفية منخفضة. ويظهر عدد التحديد الموضعي المقبول للصور المقابلة لبيانات الخلفية المرتفعة والمنخفضة في الرسم البياني الثاني. وتظهر هذه الصور الثلاث المحدودة بالحيود بيانات نموذجية لخيوط actin مسبقة التكوين ملتصقة بسطح الزجاج قبل إضافة محلول التبديل والتصوير بتقنية STORM.

يمكن ملاحظة خيوط ذات أطوال متفاوتة. وغالباً ما تكون الخيوط شديدة السطوع عبارة عن عدة خيوط متشابكة معاً. ويؤدي اختيار خيوط مفردة ساطعة نسبياً بدلاً من المناطق المتشابكة إلى الحصول على صور ذات جودة أفضل خلال مرحلة الالتقاط.

يجب ملاحظة ومضات ساطعة في بؤرة التركيز على طول الخيط. ويجب أن تظهر ومضات متفرقة خلال مرحلة الاستحواذ، ومن ثم في بيانات المعالجة. كما يجب أن يتواجد خيط مستمر رفيع، وينبغي أن تظهر التمركزات لكل إطار انخفاضاً تدريجياً.

عادةً ما يتم تقديم العرض الكامل عند نصف القيمة القصوى أو FWHM للخيط كتقدير تجريبي للدقة، وذلك عن طريق رسم خط مستقيم عبر منطقة مكبرة من خيط الأكتين باستخدام ميزة plot profile في برنامج image J، ومن ثم إجراء ملاءمة غاوسية (Gaussian fit). وقد حُسبت قيمة FWHM لتكون 43.2 nanometers. يمكن أن تحدث مشكلة في تحديد الموقع (mis localization) حيث تتفرع مجموعة من خيوط الأكتين أو تتقاطع مع بعضها البعض، وذلك من خلال معالجة مجموعات فرعية من الإطارات ومقارنة أول وآخر 5,000 إطار.

تنتج صورة مختلفة في صورة فائقة الدقة باستخدام أول 5,000 إطار، حيث تظهر العديد من التحديدات الموضعية في منتصف الصورة. ومع ذلك، عند استخدام آخر 5,000 إطار، يظهر عدد قليل جداً من هذه التحديدات الموضعية، ولا يتبقى سوى الخيوط، وإن كانت تبدو متصلة إلى حد ما نظراً لقلة عدد التحديدات الموضعية في الصورة.

إذا اشتبه في أن كثافة الوميض عالية للغاية، فإن مقارنة الصور ببيانات التوطين لكل إطار يمكن أن تشير بقوة إلى حدوث هذه المشكلة خلال المجموعة الأولى من الإطارات. حيث يبلغ متوسط عدد التوطينات لكل إطار أكثر من 10 مقارنة بالمجموعة الأخيرة من الإطارات حيث يكون العدد حوالي أربعة. وهناك مشكلة محتملة أخرى في مجهر storm وهي الانزياح، والذي يحدث عندما تتحرك العينة بالنسبة لعدسة الشيئية خلال مرحلة الحصول على البيانات، وعلى الرغم من صعوبة اكتشافه للغاية أثناء مرحلة التقاط الصور، إلا أنه يمكن اكتشاف الانزياح في صور فائقة الدقة لبنى معروفة مثل خيوط actin.

تتمثل العلامة الأولى على احتمال حدوث انزياح جانبي في أن يكون الهيكل أكبر من المتوقع. على سبيل المثال، عند وجود قيمة عرض كامل عند نصف الحد الأقصى كبيرة نسبياً مقارنة ببيانات حد الدقة من rainstorm، وفي هذه الحالة تكون 90 nanometers مقارنة بـ 67 nanometers. وهناك طريقة أفضل للكشف عن الانزياح وهي مقارنة التحديدات الموضعية كدالة في الزمن، أي التحقق مما إذا كانت التحديدات الموضعية في الإطارات اللاحقة مزاحة مقارنة بتلك الموجودة في الإطارات المبكرة.

يمكن رؤية ذلك بوضوح في حالة خيوط الأكتين عند عرضها بترميز لوني. باستخدام ميزة تتبع المربع في rainstorm كما هو موضح في اللوحتين B و c، يتم عرض التموضعات بلون يتوافق مع رقم الإطار الذي تم التقاطها فيه. على سبيل المثال، تظهر التموضعات من بداية تسلسل الاستحواذ باللون الأزرق، بينما تظهر التموضعات من نهاية تسلسل الاستحواذ باللون الأحمر.

تشير الألوان المزاحة إلى حدوث انزياح يجب قياسه وتصحيحه. ولتحديد هذا الانزياح، يمكن استخدام حبيبات فلورية بقطر 100 nanometer كعلامات مرجعية؛ وتوضح الأرقام من واحد إلى أربعة صوراً مقصوصة ومكبرة لكل حبيبة على حدة. وفي مثال حدث فيه انزياح شديد نسبياً يبلغ حوالي 100 nanometers على مدار ثلاث دقائق و 10 seconds خلال مرحلة الاستحواذ، يمكن استخدام ميزة تتبع المربعات نفسها لترميز الانزياح بالألوان وتأكيد حدوثه؛ وبما أن الحبيبات الأربع في هذا المثال أظهرت انزياحاً متطابقاً تقريباً، فمن الممكن اختيار إحداها في هذه الحالة (الحبيبة رقم اثنين) لاستخدامها كمرجع وطرح قيمة الانزياح من الحبيبات الأخرى.

تظهر المقارنة مع اللوحة E أنه قد تم تصحيح الانزياح الجانبي. وأخيراً، يمكن استخدام خلايا hela المصبوغة بعامل نمو البشرة لتقديم مثال واقعي على دقة الصورة. وفي الخلايا، تظهر اللوحة A صورة محدودة بالحيود لجزء من خلية hela مركزة عند السطح القاعدي للخلية، حيث تشير المربعات الصفراء إلى مناطق اهتمام مكبرة معروضة في اللوحتين B و C، وذلك على عكس مناطق الاهتمام المكبرة غير الواضحة في الصورة المحدودة بالحيود.

يجب أن تُظهر صور فائقة الدقة خليطاً من التجمعات وبكسلات مفردة معزولة أحياناً. سيكون قطر هذه التجمعات حوالي 100 nanometers، ومن المرجح أن تعبر عن النقر والحويصلات الآخذة في التشكل. يتم عرض بيانات التموضع لكل إطار للمسار الذي يتم من خلاله تقليل تنظيم EGF وإدخاله خلويًا بشكل أساسي من اللوحة D في الرسم البياني G. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير بعض عينات الاختبار البسيطة، واكتساب البيانات وإعادة بناء صور STORM عالية الجودة وفائقة الدقة.

ستساعد هذه الطرق في تجنب بعض عيوب الملاءمة الشائعة مثل الانزياح، وتساعد في تحسين عملية الـ storm الخاصة بك. راجع تجارب الدقة.