المجهر الفريد لتحديد الجزيء الواحد لبروتينات الغشاء باستخدام وسم الجسم المضاد الواحد

يركز بحثي على غشاء الخلايا التائية ويهدف إلى كشف رؤى جديدة على المستوى النانوي ذات صلة بالاستهداف العلاجي. عادة لا تتصور طرق التصوير الحالية تفاعلات الأجسام المضادة والحاضمة على المستوى النانوي مباشرة في الخلايا. يتغلب هذا البروتوكول على هذا القيد من خلال تمكين الملاحظة المباشرة داخل البيئة الخلوية.

بعد تركيب العينة على المجهر وترسيب الكولويدات الذهبية على السطح، استخدم إضاءة الحقل الساطع للتحقق من ترسيب عدد كاف من الكولويدات ضمن منطقة الاهتمام. تأكد من وجود كثافة مثالية تتراوح بين 5 إلى 10 كولويدات ذهبية ضمن منطقة الاهتمام قبل المضي قدما. للتكوين البصري لمسبار الأجسام المضادة فلوروفور، افتح برنامج التصوير وقم بالوصول إلى إعدادات التكوين البصري.

اختر المرآة ثنائية اللون المناسبة وحدد طول موجة الإثارة والكثافة الكهربائية. قم بضبط وقت دمج الكاميرا واختر مرشح الانبعاث. ثم ضبط تجميع بكسل الكاميرا لتحقيق حجم بكسل يتراوح بين 150 إلى 160 نانومتر.

الآن، أنشئ إعدادا بصريا لخطوة تبييض الصور عن طريق اختيار وضع تبييض الصور في برنامج التصوير. اضبط طاقة الليزر على 100٪ وعدل وقت دمج الكاميرا إلى ثانية واحدة. حدد معلمات التصوير في برنامج التقاط الصور عن طريق تحديد الفترة غير المضيئة، وعدد الإطارات، وتكرار خطوة التبييض الضوئي.

بعد ذلك، جهز المخزن التصويري عن طريق تخفيف الجسم المضاد CD81 إلى تركيز 1 ميكروغرام لكل ملليلتر في 200 ميكرولتر من 5٪ BSA المصنوع في DPBS. التركيز النهائي الموصى به للأجسام المضادة هو 0.5 نانومولار لخلايا جوركات التائية، أو 2 نانومولار لخلايا U-2 OS. أضف مخزن التصوير المحضر إلى البئر الذي يحتوي على الخلايا وابدأ جمع الصور في البرنامج لبدء جمع البيانات.

استخدم وظيفة العرض المباشر في برنامج التصوير المهيأ لوضع علامات على الجسم المضاد الواحد على الغشاء لمراقبة ارتباط الأجسام المضادة في الوقت الحقيقي. قم بتكوين معلمات التصوير في برنامج التقاط الصورة للحصول على التقاط لا يقل عن 10 إطارات واضبط الفترة غير المضيئة إلى خمس ثوان. ابدأ عملية الجمع وقيم ندرة مواقع الجزيء الواحد في الفيلم المسجل.

إذا لوحظت عدة أحداث ارتباط أجسام مضادة متداخلة فور إضافة مخزن التصوير، أو إذا تراكمت مواقعها على جزيء واحد مع مرور الوقت، أوقف عملية الاكتساب. قلل تركيز الأجسام المضادة بمقدار مرتين وكرر عملية الاقتناء على عينة جديدة. استمر في تقليل تركيز الأجسام المضادة بمقدار مرتين وإعادة تقييم عدد الأحداث لكل وحدة مساحة حتى يتم تحقيق كثافة التمركز الجزيء الواحد المطلوبة.

إذا كانت كثافة الحدث قليلة، قم بزيادة تركيز الأجسام المضادة في مخزن التصوير بمقدار مرتين. كرر عملية الاستحواذ على عينة جديدة واستمر في زيادة تركيز الأجسام المضادة بمقدار مرتين مع إعادة تقييم عدد أحداث الارتباط لكل وحدة مساحة حتى يتم تحقيق كثافة التموقع الجزيء الواحد المطلوبة. لتحسين الفترات غير المضيئة، قم بتكوين معلمات التصوير في برنامج التقاط الصورة للحصول على اقتناص 50 إطارا.

بعد إضافة الجسم المضاد وبدء الاكتساب، قيم كثافة وتنوع التوطين الجزيءي الواحد في الفيلم المسجل. تحديد أدنى فترة غير مضيئة تعطي كثافة مثالية لحدث جزيء واحد. وأخيرا، إذا حدثت أحداث ارتباط متداخلة مكانيا مع تقدم التقاط الصورة، قدم خطوة تبييض الصور على فترات منتظمة.

اضبط تردد التبييض الضوئي بحيث يتم إزالة الفلورة من الأجسام المضادة المرتبطة قبل تراكم الأحداث المتداخلة. قم بتعيين مسار الملف في برنامج MATLAB إلى المجلد الذي يحتوي على ملف القيم المفصولة بفواصل الخلية M المعاد بناؤه. شغل الكود بالنقر على تشغيل في شريط أدوات MATLAB.

عند الطلب، اختر ملف CSV الخاص ب M cell واضغط على فتح لتحميله في البرنامج. شغل التحليل باستخدام المدخلات المعرفة مسبقا كنقطة بداية. تقييم مخطط التشتت الذي يحتوي على بيانات التوطين غير المجمعة.

اختر قيمة نقطة دنيا أعلى من عدد مواقع الضوضاء ولكن أقل من عدد التوطين على الخلية. قيم النافذة التي تعرض البيانات المجمعة. تأكد من أن العناقيد محتجزة على الخلية مع النمط الظاهري المتوقع بينما يتم تقليل التمركز خارج الخلية.

إذا كانت معاملات التجميع مقيدة جدا، قلل قيمة النقاط الدنيا وزد الإبسيلون. إذا كانت معايير التجميع شاملة جدا، قم بزيادة قيمة النقاط الدنيا وقلل من إبسيلون. وأخيرا، بعد تعديل قيمة النقاط الدنيا وإبسيلون، أعد تشغيل الكود للحصول على أفضل تجميع للمجموعة.

تم تثبيت خلايا جوركات التائية بمسافة كافية للحفاظ على سلامة الغشاء والسماح للأجسام المضادة بالوصول إلى الحواتم الغشائية. تم تصور الكولويدات الذهبية واستخدامها كعلامات ائتمانية لتصحيح الانجراف الجانبي أثناء التقاط صورة الخلايا M. أظهر تحسين فترة عدم الإضاءة أن فترة خمس ثوان تنتج أحداث ارتباط الأجسام المضادة مع تداخل مكاني ضئيل مقارنة بفترات أقصر أو أطول عند تركيز واحد للأجسام المضادة النانومولر.

تطبيق تصحيح الانجراف حسن صورة الخلية M المعاد بناؤها مقارنة بإعادة البناء غير المصححة. أدى التجميع القائم على الكثافة لتوطين خلايا M إلى تقليل التفاعلات الخلفية منخفضة الكثافة وأبرز أحداث ارتباط CD81 المجمعة. يمكننا ملاحظة تفاعل الأجسام المضادة مع حواتم الغشاء في بيئة خلوية، مما يوفر رؤى ذات صلة بالأجسام المضادة العلاجية.

تركيز الأجسام المضادة، وفترة عدم الإضاءة، وخطوات التبييض الضوئي ضرورية للتحسين. المعاملات غير المثالية ستؤثر على النتائج. يمكن توسيع وسم الجسم المضاد الواحد لتقييم ارتباط البروتينات الغشائية بواسطة عدة أجسام مضادة ضمن نفس البيئة الخلوية في نفس الوقت في نفس الغلاف الخلوي.