القرار فائقة الارتباطية والميكروسكوب الإلكتروني لحل التعريب البروتين في الشبكية الزرد

ويصف هذا البروتوكول الخطوات اللازمة للحصول على نتائج التعريب سوبسيلولار البروتين في الشبكية الزرد بربط القرار سوبر الخفيفة الميكروسكوب ومسح صور المجهر الإلكتروني.

الهدف العام من طريقة الفحص المجهري هذه هو توطين تعبير البروتين بدقة فيما يتعلق بالعضيات الخلوية المختلفة في شبكية الزرد اليرقاتية من خلال ربط صور الفحص المجهري الإلكتروني فائقة الدقة ومسح الصوت. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات تطور الشبكية والمسار الخلوي ، مثل دراسة توطين البروتين الخاطئ في الطفرات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تجمع بين الدقة الفائقة والفحص المجهري الإلكتروني الماسح للحصول على بيانات توطين البروتين عالية الدقة في السياق الهيكلي للعينة.

تسهل مجموعة أقسام Tokuyasu على رقائق السيليكون المناولة بشكل كبير ويوفر استخدام التظليل البلاتيني للتباين تضاريس جيدة للعينة. لذلك ، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لدراسات شبكية اليرقات الزردية. تتمثل إحدى مزاياه الرئيسية في أنه يمكن تطبيقه أيضا على العديد من الأنظمة البيولوجية الأخرى ، مثل تحديد تعبير البروتين في أنسجة الفئران.

بعد تشريح العينين من يرقات الزرد الثابتة وفقا لبروتوكول النص ، قم بتسخين 15 مل من الجيلاتين ذو العلامة التجارية الغذائية المحلية بنسبة 12٪ في PBS عند 40 درجة مئوية. ثم استنشق PBS من أنابيب العين وأضف محلول الجيلاتين. اضغط برفق على الأنبوب للتأكد من تسرب الجيلاتين إلى العينة ، واحتضانه لمدة 10 إلى 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية في كتلة حرارية مع رج لطيف أو في حمام مائي.

في حمام مائي 40 درجة مئوية ، املأ قوالب التضمين المسطحة من السيليكون أو البولي إيثيلين 12 × خمسة × ثلاثة ملم بالجيلاتين الدافئ. ثم باستخدام ماصة ، أضف عينين لكل قالب وتحت مجهر استخدم إبرة تشريح لمحاذاة العينين بشكل صحيح. بعد ترك الجيلاتين يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة ، ضعه على أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة حتى يتماسك.

تحت المجهرين ، استخدم شفرة حلاقة لإعادة تشذيب كتلة الجيلاتين لتناسب عين واحدة لكل كتلة. انقل عيون الجيلاتين المضمنة إلى 2.3 سكروز مولار في PBS على الجليد. احتضان العينات عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

ثم استبدل العينات بمحلول السكروز الطازج 2.3 المولار. وقم بتخزين الأنسجة عند أربع درجات مئوية ، أو 20 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين لمدة تصل إلى عدة أشهر. أعد تقليم كتلة الجيلاتين إلى حجم العين تقريبا قبل نقلها إلى دبوس التبريد.

ثم قم بتجميد الكتلة في النيتروجين السائل ، وانقلها إلى ميكروتوم فائق التبريد. باستخدام سكين ماسي في cryo-ultramicrotome ، قم بقطع أقسام بسمك 110 نانومتر عند 120 درجة مئوية تحت الصفر. اختر الأقسام ذات الحلقة السلكية التي تحتوي على قطرة من 2٪ ميثيل السليلوز و 2.3 محلول سكروز مولي.

ثم انقل الأقسام إلى رقاقة سيليكون سبعة × سبعة ملليمترات. لغسل الرقائق ، قم بتقطيع أربع قطرات ، وضع الرقائق رأسا على عقب على القطرات. احتضن الرقائق على القطرات عند صفر درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

ثم اغسل الرقائق مرتين في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين لكل منهما. احتضان العينات ثلاث مرات في 0.15٪ جلايسين في PBS لمدة دقيقة واحدة لكل منها. ثم استخدم PBS لغسل العينات ثلاث مرات لمدة دقيقة واحدة لكل غسلة.

باحتضان الأنسجة مسبقا باستخدام PBG لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف الأرنب المضاد ل Tom20 في PBG إلى الأقسام. واحتضان الرقائق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

باستخدام PBG ، اغسل المنديل ست مرات لمدة دقيقة واحدة لكل غسلة. ثم قم باحتضان العينات مسبقا باستخدام PBG في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. استبدل PBG ب Alexa 647 شظايا Fab المضادة للأرانب في PBG ، واحتضنها لمدة 30 دقيقة.

اغسل العينات في PBG ست مرات لمدة دقيقة واحدة لكل غسلة. ثم استخدم PBS لغسل الرقائق ثلاث مرات لمدة دقيقتين. أضف DAPI و PBS إلى الرقائق واحتضانها لمدة 10 ثوان.

ثم استخدم PBS لغسل العينات مرتين لمدة دقيقتين لكل منهما. ضع الرقاقة على قطرة من محلول واحد إلى واحد من 80٪ من الجلسرين ومخزن التصوير الذي يحتوي على نظام كسح الأكسجين واحتضانه لفترة وجيزة. انقل الرقائق ، بحيث يكون جانب الأنسجة لأسفل ، على قطرة جديدة من خليط واحد إلى واحد من 80٪ من الجلسرين ومخزن التصوير على طبق بتري ذو قاع زجاجي.

استخدم ماصة من جميع الجوانب لإزالة معظم السائل الموجود أسفل الرقاقة. ثم استخدم خطوط السيليكون لتثبيت الرقاقة في قاع طبق بتري. ضع الأقسام المركبة على مجهر مقلوب بهدف غمر الزيت بفتحة عددية عالية.

قبل التصوير ، دع العينة تتوازن مع درجة حرارة المجهر لتقليل أو تقليل الانجراف الجانبي والمحوري. قم بتوسيط مجال الاهتمام واحصل على صور مرجعية واسعة النطاق للتألق العرضي. قم بالتغيير إلى وضع التشغيل فائق الدقة.

اضبط وقت التعرض للكاميرا على 15 مللي ثانية واضبط كسب ضرب الإلكترون على 300 كحد أقصى. بعد ذلك ، قم بإضاءة العينة في وضع التألق باستخدام ليزر 642 نانومتر بأقصى طاقة ليزر. بمجرد أن يتم فصل وميض الجزيء الفردي جيدا في كل إطار ، بحيث يكون احتمال تداخل الإشارات الفردية منخفضا ، قلل من طاقة الليزر إلى ما يقرب من 1/3.

سجل الصورة الأولية في التألق السطحي من خلال الحصول على ما لا يقل عن 30،000 إطار. من البيانات الأولية ، ضمن الأدوات ، يستخدم تحليل سلسلة t عتبة كشف تبلغ 30 فوتونا. انقر فوق تقييم لإنشاء قائمة أحداث الترجمة.

ضمن أدوات، في لوحة معالجة قائمة الأحداث، انقر فوق إنشاء صورة لتصور الصورة فائقة الدقة حسب التركيب الغوسي، مع تطبيق حجم بكسل عرض يبلغ أربعة نانومتر. قم بإزالة خطوط السيليكون ، وأضف قطرة من PBS بالقرب من حواف الرقاقة لرفعها من طبق بتري. بعد استخدام PBS لغسل الرقاقة مرتين لمدة دقيقتين لكل منهما ، استخدم 0.1٪ جلوتارالديهايد في PBS لإصلاحه بعد خمس دقائق.

ثم اغسل العينة مرة أخرى مرتين لمدة دقيقتين لكل غسلة في PBS. احتضان الرقاقة في قطرة واحدة من 2٪ ميثيل السليلوز في الماء على الجليد مرتين لمدة خمس دقائق لكل حضانة. ثم أدخل الرقاقة في أنبوب الطرد المركزي ، وجهاز الطرد المركزي عند 14 ، 100 مرة جم لمدة 90 ثانية.

بعد الدوران ، استخدم الأسمنت الكربوني الموصل لتركيب الرقاقة على كعب الألومنيوم SEM. باستخدام جهاز تبخر شعاع الإلكترون ، أضف طبقة من اثنين إلى 10 نانومتر من الكربون البلاتيني على العينة عن طريق التظليل الدوار بالإعدادات التالية. أقسام الصور بمجهر إلكتروني ماسح عند 1.5 كيلو فولت ، ومسافة عمل ملليمترين ، ومع كاشف الإلكترون الثانوي في العدسة.

استخدم فيجي لفتح كل من صور المجهر الضوئي والإلكترون بالنقر فوق ملف، فتح. اضبط حجم اللوحة القماشية بالنقر فوق صورة ، ضبط ، حجم اللوحة القماشية. ثم قم بإحضار كلتا الصورتين إلى مكدس بالنقر فوق صورة ، مكدسات ، صور للتكديس.

في فيجي ، افتح واجهة EM2 جديدة للمسار بالنقر فوق ملف ، جديد ، مسار EM2 جديد. قم باستيراد المكدس بكلتا الصورتين عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على النافذة السوداء وتحديد مكدس الاستيراد. قم بمحاذاة صورة المجهر الضوئي مع صورة المجهر الإلكتروني يدويا مع المعالم باستخدام نقرة بزر الماوس الأيمن على الصورة وتحديد محاذاة الطبقة يدويا مع المعالم.

اختر أداة تحديد لإضافة معالم. استخدم شكل النوى كمرجع لتحديد نفس الحواف في كلتا الصورتين وإضافة عدة نقاط. قم بتطبيق المحاذاة مع نموذج affine بالنقر بزر الماوس الأيمن وحدد تطبيق التحويل ، نموذج Affine.

أخيرا ، قم بتغيير شفافية الطبقة لتقييم جودة المحاذاة. تظهر هذه اللوحة صورة مجال واسع منخفض التكبير لقسم شبكية السمكة الزرد بعد خمسة أيام. تظهر نفس المنطقة هنا عن طريق مسح المجهر الإلكتروني.

تظهر صور التكبير الأعلى هذه صبغة Tom20 باللون الأحمر مع مجموعات في الميتوكوندريا. يظهر تعبير Tom20 هنا كما تم اكتشافه بواسطة الفحص المجهري GSDIM. في هذه الصورة ، يجمع نفس القسم بين الدقة الفائقة المترابطة والفحص المجهري الإلكتروني الماسح.

يظهر تلطيخ Tom20 داخل مجموعة الميتوكوندريا في الأغشية الخارجية للميتوكوندريا. تتوافق إشارة DAPI الفلورية في النوى مع تضاريس صورة SEM. توفر صورة التسويق عبر محرك البحث هذه سياقا لتلوين Tom20 في صورة GSDIM.

كريستا الميتوكوندريا بوضوح ، ويتم توطين تلطيخ Tom20 في الأغشية الخارجية للميتوكوندريا. يتم حل أغشية الجزء الخارجي لمستقبلات الصور بوضوح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحسين معلمات الملصقات والتصوير بأفضل ما يمكن.

فقط العينات ذات العلامات المثلى مناسبة للدقة الفائقة. يجب ألا تجف العينات أبدا في أي وقت أثناء إجراء وضع العلامات. يمكن تمديد هذا الإجراء إلى التألق المناعي المزدوج ، وبالتالي السماح بتوطين بروتينين مختلفين داخل بنية معينة.

في حالة وجود عينات أكثر تعقيدا ، يوصى باستخدام العلامات الإيمانية للحصول على محاذاة دقيقة للصور. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء دراسات مترابطة لتوطين البروتينات فيما يتعلق بالعضيات المختلفة للخلية في عينة أنسجة معقدة بدقة فائقة الدقة.