اشتقاق مدار الساعة من تخليص الغلوتامات مع تحليل Deconvolution من التيارات الناقل نجمي

الهدف العام من التجربة هو تقدير المجرى الزمني لتنقية الغلوتامات من أغشية الخلايا النجمية عقب إطلاقها من المشابك العصبية الاستثارية. وتتمثل الخطوة الأولى في هذه العملية في تسجيل حدوث نقل الغلوتامات المنشط مشبكياً من الخلايا النجمية في شرائح دماغية حادة، وذلك في حالة الغياب والحضور لتركيز غير مشبع من مضاد ناقلات الغلوتامات واسع الطيف TBOA. أما الخطوة الثانية فهي تحليل التسجيلات لعزل تيارات ناقلات الغلوتامات المنشطة مشبكياً عن جميع المكونات الأخرى للاستجابة المستثارة.

بعد ذلك، يتم تقدير المخطط الزمني للترشيح من خلال تحليل تيارات الناقل المسجلة في وجود TBOA عن طريق طرح تيارات المرشح من عملية النقل المسجلة في ظروف مضبوطة. وبذلك يتم الحصول على المخطط الزمني لتنقية الغلوتامات من أغشية الخلايا النجمية. وتظهر النتائج أنه في حصين الفأر، تتطلب الخلايا النجمية بضع ميلي ثوانٍ فقط لإزالة الغلوتامات المنطلقة مشبكيًا من الحيز خارج الخلوي.

يوفر هذا النهج أداة حساسة للكشف عن التغيرات في قدرة الخلايا النجمية على الامتصاص في مناطق مختلفة من الدماغ خلال الظروف الفسيولوجية والمرضية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذا النهج مقارنة بالطرق الأخرى التي تعتمد، على سبيل المثال، على تحليل إزاحة مضادات مستقبلات الغلوتامات سريعة التفكك على مؤشرات الغلوتامات الفلورية أو على محاكاة الكمبيوتر لتفاعلات الانتشار، في توفيره لدقة زمنية عالية، وقراءة تجريبية مباشرة لتخليص الغلوتامات من الخلايا النجمية. تتيح لنا هذه الطريقة فهم الديناميكيات المكانية والزمانية للنقل المشبكي في الدماغ.

يمكن أن يساعدنا ذلك في تفسير التغيرات الفيزيولوجية المرضية في الغلوتامات والانتشار والامتصاص التي قد تحدث في بعض الاضطرابات العصبية مثل مرض Alzheimer's. ابدأ هذا الإجراء بإجراء خمسة شقوق في دماغ فأر مُشرح باستخدام مشرط. أولاً، قم بإزالة البصلات الشمية والقشرة الجبهية.

ثانياً، قم بإزالة المخيخ. بعد ذلك، قم بإزالة الفصين الصدغيين الأيمن والأيسر. ثم افصل نصفي الكرة المخية عن طريق قطع سهمي وسطي.

بعد ذلك، قم بلصق السطح الجانبي لكل مقطع من مقاطع الدماغ على لوحة قاعدة vibram الباردة. يجب أن يكون الجانب الظهري للدماغ مواجهاً لشفرة Vibram، بينما يكون الجانب البطني للدماغ ملامساً لكتلة الآجار بعيداً عن شفرة vibrato. ثم قم بتثبيت لوحة قاعدة vibrato في غرفة التشريح.

اضبط سمك الشريحة على 250 micrometers وقم بتعديل عرض الشفرة قبل البدء في التقطيع. وبمجرد مرور الشفرة عبر القشرة والحصين، استخدم مشرطاً لفصل القشرة والحصين عن الدماغ المتوسط. بعد ذلك، ضع شريحة في غرفة الغمر عند درجة حرارة 34 degrees Celsius بعد الاحتفاظ بالشرائح عند درجة حرارة 34 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة.

اتركها تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل استخدامها في تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربائية في هذا الإجراء، ثم انقل شريحة إلى غرفة التسجيل. افحص الشريحة بصرياً تحت الإضاءة النقطية أو I-R-D-I-C. يمكن التعرف على الخلايا النجمية من خلال جسم الخلية الصغير والنواة البارزة من أجل التحفيز المشبكي.

ضع قطبًا كهربائيًا ثنائي القطب من الفولاذ المقاوم للصدأ على بُعد حوالي 100 micrometers من الخلية النجمية التي تخطط لتثبيتها. قم بتثبيت الخلية النجمية والكسر للوصول إلى تكوين الخلية الكاملة عن طريق تطبيق شفط خفيف جدًا. بعد ذلك، قم بالتبديل بين المحفزات الفردية والمزدوجة كل 10 إلى 20 ثانية لعزل الأجزاء الميسرة من حدوث النقل المنشط مشبكيًا.

أولاً، يتم حساب متوسط 20 مسحاً على الأقل تم الحصول عليها من خلال التحفيزات المزدوجة في ظروف ضبطية، وبوجود 10 micromolar من مضاد ناقل الغلوتامات واسع الطيف TBOA. ثم يتم حساب متوسط عدد مماثل من المسوحات التي تم الحصول عليها من خلال تحفيزات فردية في ظروف ضبطية وفي وجود 10 micromolar من TBOA، ويُطرح متوسط الأثر الناتج عن التحفيزات الفردية من متوسط الأثر الناتج عن التحفيزات المزدوجة. تسمح هذه الخطوة بعزل STO الهندسي وتيار البوتاسيوم المستدام الذي استحثه التحفيز الثاني.

بعد ذلك، يتم إزاحة متوسط الأثر الذي تم الحصول عليه من خلال التحفيزات الفردية بفارق زمني يطابق فاصل PUL المستخدم لإيصال النبضات المزدوجة، ثم يُطرح هذا الاستجابة المتوسطة المزاحة زمنياً، والتي تم الحصول عليها من خلال التحفيزات الفردية، من الاستجابة المتوسطة للمحفز الثاني التي تم الحصول عليها مسبقاً. تعمل هذه الخطوة على عزل الجزء الميسّر من تيار الناقل الذي استحثه المحفز الثاني. وفي معظم الحالات، تؤدي هذه الخطوة إلى إزالة تيار البوتاسيوم المستمر تماماً.

إذا كان الأمر كذلك، فإن عملية عزل FSTC قد اكتملت، ويمكنك المضي قدماً في تحليل فك الالتفاف (deconvolution analysis) والوصول إلى المخطط الزمني لتخليص الغلوتامات من الخلايا النجمية. ومع ذلك، في بعض الحالات، يظل هناك تيار بوتاسيوم مستدام صغير، مما يتطلب إجراء مزيد من التحليل. قم بقياس سعة تيار البوتاسيوم المستدام المتبقي بعد التنفيذ.

يقوم التحليل الموصوف سابقاً بمقايسة سعة الدالة الأسية الأحادية وفقاً لسعة تيار البوتاسيوم المستمر المتبقي، وذلك عن طريق تعيين سعة تيار البوتاسيوم المستمر المقاس كقيمة a في هذه المعادلة. ولكن ثابت زمن الصعود يمثل القيمة المتوسطة للصعود المقدرة في تجارب منفصلة تم فيها عزل تيار البوتاسيوم المستمر. يتم ذلك دوائياً باستخدام تركيز مشبع عالٍ من TBOA، ثم تُطرح الدالة الأسية الأحادية الناتجة من FSTC وتيار البوتاسيوم المستمر.

لإتمام عزل FSTC. لعزل حدوث النقل المنشط بالومضة الضوئية. يتم حساب متوسط 20 مسحاً على الأقل تم الحصول عليها والمسار الضوئي مفتوح في الظروف الضابطة وفي وجود 10 micromolar TBOA، ثم يتم حساب متوسط نفس العدد من المسوحات التي تم الحصول عليها والمسار الضوئي مغلق في الظروف الضابطة وفي وجود 10 micromolar TBOA، ثم يُطرح متوسط الأثر الذي تم الحصول عليه والمسار الضوئي محجوب من متوسط الأثر الذي تم الحصول عليه والمسار الضوئي مفتوح.

تسمح هذه الخطوة بإزالة أثر التحفيز وعزل الـ FTCs؛ في هذه الخطوة، يتم مواءمة تيار النقل، سواء كان FSTC أو FTC المسجل في ظروف التحكم وفي 10 micromolar TBOA، ومواءمتها باستخدام دالة متعددة الأسس، وإنشاء دالة صاعدة لحظياً تتلاشى بشكل أحادي الأس وفقاً لهذه الدالة والتي تصف بشكل أفضل مرحلة التلاشي لتيار الناقل المسجل عند 10 micromolar TBOA. بعد ذلك، يتم اشتقاق الدالة أحادية الأس من مواءمة تيار الناقل المسجل في 10 micromolar TBOA لاستنباط المرشح. ثم يتم اشتقاق المرشح من مواءمة تيار الناقل في ظروف التحكم.

للحصول على تقدير كمي للمسار الزمني الإجمالي لتصفية الغلوتامات، احسب الـ OID للموجة. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التأكد من تسجيل أحداث النقل تحت ظروف تجريبية يعمل فيها المرشح في نظام خطي ويحدث تشوهات خطية فقط في عملية النقل. يمكن التحقق من موجة التيار من خلال فحص التلاعبات التي تغير حجم تيار النقل.

لا تغير مسار الختم الخاص به. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام التسجيلات النجمية لاستخراج معلومات حول الغلوتامات والانتشار والامتصاص في الدماغ.