اشتقاق مدار الساعة من تخليص الغلوتامات مع تحليل Deconvolution من التيارات الناقل نجمي

الهدف العام من التجربة هو تقدير المسار الزمني لإزالة الغلوتامات من الأغشية النجمية بعد إطلاقها من نقاط الاشتباك العصبي المثيرة. تتمثل الخطوة الأولى في هذه العملية في تسجيل حدوث نقل الغلوتامات المنشط متشابك من الخلايا النجمية في شرائح الدماغ الحادة في غياب ووجود تركيز مشبع للغواصات لمضاد ناقل الغلوتامات واسع الطيف ، TBOA. الخطوة الثانية هي تحليل التسجيلات لعزل تيارات ناقل الغلوتامات المنشطة بشكل متشابك عن جميع المكونات الأخرى للاستجابة المستحثة.

بعد ذلك ، يتم تقدير المسار الزمني للمرشح من خلال تحليل التيارات الناقلة المسجلة في وجود TBOA بواسطة de إشراك المرشاح من حدوث النقل المسجل في ظروف خاضعة للرقابة. يتم الحصول على المسار الزمني لإزالة الغلوتامات من الأغشية النجمية. تظهر النتائج أنه في الحصين الفأر ، لا تتطلب الخلايا النجمية سوى بضعة أجزاء من الثانية لإزالة الغلوتامات التي تم إطلاقها بشكل متشابك من قاعدة الفضاء خارج الخلية.

يوفر هذا النهج أداة حساسة للكشف عن التغيرات في قدرة الامتصاص النجمي في مناطق مختلفة من الدماغ أثناء الظروف الفسيولوجية والمرضية. الميزة الرئيسية لهذا النهج على الطرق الأخرى التي تستند ، على سبيل المثال ، إلى تحليل الإزاحة لمضادات مستقبلات الغلوتامات سريعة التفكك على مؤشرات الغلوتامات الفلورية أو على المحاكاة الحاسوبية لتفاعل الانتشار ، هي أنه يوفر دقة زمنية عالية ، قراءة تجريبية مباشرة لإزالة الغلوتامات من الخلايا النجومية. تسمح لنا هذه الطريقة بفهم الديناميكيات المكانية والزمانية للانتقال المشبكي في الدماغ.

يمكن أن يساعدنا في تفسير التغيرات الفيزيولوجية المرضية في الغلوتامات والانتشار والامتصاص التي قد تحدث في بعض الاضطرابات العصبية مثل مرض الزهايمر. ابدأ هذا الإجراء بعمل خمس جروح على دماغ الفأر المقطوع بمشرط. أولا ، قم بإزالة البصيلات الشمية والقشرة الأمامية.

ثانيا ، قم بإزالة المخيخ. بعد ذلك ، قم بإزالة الفص الصدغي الأيمن والأيسر. ثم افصل نصفي الكرة المخية مع قطع سهمي.

بعد ذلك ، قم بلصق السطح الجانبي لكل قسم من أقسام الدماغ على لوحة قاعدة الاهتزاز الباردة. يجب أن يكون الجانب الظهري من الدماغ مواجها لشفرة الاهتزاز ويجب أن يكون الجانب البطني من الدماغ ملامسا لكتلة أجار بعيدا عن شفرة الاهتزاز. ثم قم بتثبيت لوحة قاعدة الاهتزاز في غرفة التشريح.

اضبط سمك الشريحة على 250 ميكرومتر واضبط عرض الشفرة قبل التقطيع. بمجرد مرور الشفرة عبر القشرة والحصين ، استخدم مشرطا لقطع حصين القشرة من الدماغ المتوسط. بعد ذلك ، ضع شريحة في غرفة الغمر على حرارة 34 درجة مئوية بعد إبقاء الشرائح عند 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

دعهم يبردوا إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل استخدامها لتسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية في هذا الإجراء ، انقل شريحة إلى غرفة التسجيل. افحص الشريحة بصريا تحت الإضاءة النقطية أو I-R-D-I-C. يمكن التعرف على الخلايا النجمية من خلال جسم الخلية الصغير والنواة البارزة للتحفيز المتشابك.

ضع قطبا كهربائيا ثنائي القطب من الفولاذ المقاوم للصدأ على بعد حوالي 100 ميكرومتر من الخلايا النجمية التي تخطط لتصحيحها. قم بتصحيح الخلايا النجمية وكسر تكوين الخلية بالكامل عن طريق تطبيق شفط لطيف للغاية. ثم قم بتبديل المحفزات الفردية والمزدوجة كل 10 إلى 20 ثانية لعزل الأجزاء الميسرة من حدوث النقل المنشط متشابكيا.

المتوسط الأول ، تم الحصول على 20 عملية مسح على الأقل مع التحفيز المزدوج في ظروف خاضعة للرقابة ، وفي وجود 10 ميكرومولار مضاد ناقل الغلوتامات واسع الطيف. ثم يقوم TBOA بمتوسط عدد متطابق من عمليات المسح التي تم الحصول عليها بمحفزات فردية في ظروف التحكم وفي 10 ميكرومولار TBOA يطرح متوسط التتبع الذي تم الحصول عليه بمحفزات فردية من متوسط التتبع الذي تم الحصول عليه من خلال التحفيز المزدوج. تسمح هذه الخطوة بعزل STO الهندسي وتيار البوتاسيوم المستمر الذي يثيره الحافز الثاني.

التحول التالي ، متوسط التتبع الذي تم الحصول عليه بمحفزات فردية بفاصل زمني يطابق فاصل PUL المستخدم لتوصيل النبضات المزدوجة يطرح الوقت المتحول ، متوسط الاستجابة التي تم الحصول عليها بمحفزات فردية من متوسط الاستجابة إلى الحافز الثاني الذي تم الحصول عليه سابقا. تعزل هذه الخطوة جزءا ميسرا من تيار الناقل الذي أثاره الحافز الثاني. في معظم الحالات ، تزيل هذه الخطوة تيار البوتاسيوم المستمر تماما.

إذا كانت هذه هي الحالة ، فإن عزل FSTC قد اكتمل ويمكنك متابعة تحليل الالتفاف والوصول إلى المسار الزمني لإزالة الغلوتامات من الخلايا النجمية. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، لا يزال هناك تيار بوتاسيوم صغير مستدام ويلزم إجراء مزيد من التحليل. قم بقياس سعة تيار البوتاسيوم المستمر المتبقي بعد الأداء.

وصف التحليل سابقا بقياس سعة الدالة الأسية الأحادية إلى سعة تيار البوتاسيوم المستدام المتبقي عن طريق ضبط سعة تيار البوتاسيوم المستدام المقاس كأ في هذه المعادلة. لكن ثابت وقت الارتفاع يمثل متوسط قيمة الارتفاع المقدرة في تجارب منفصلة يتم فيها عزل تيار بوتاسيوم مستمر. من الناحية الدوائية ، باستخدام تركيز مشبع عال من TBOA ، ثم طرح الوظيفة الأسية الأحادية الناتجة من FSTC وتيار البوتاسيوم المستمر.

لاستكمال عزل FSTC. لعزل حدوث النقل المنشط بالفلاش. متوسط ما لا يقل عن 20 عملية مسح تم الحصول عليها مع فتح مسار الضوء في ظروف التحكم وفي 10 ميكرومولار TBOA ثم متوسط نفس عدد عمليات المسح التي تم الحصول عليها مع إغلاق مسار الضوء في ظروف التحكم ، وفي 10 ميكرومولار TBOA يطرح متوسط التتبع الذي تم الحصول عليه مع مسار الضوء المحظور من متوسط التتبع الذي تم الحصول عليه مع فتح مسار الضوء.

تسمح هذه الخطوة بإزالة القطعة الأثرية المحفزة وعزل FTCs في هذه الخطوة تناسب تيار النقل إما FSTC أو FTC المسجلة في ظروف التحكم وفي 10 ميكرومولار TBOA وتلاءميتها بوظيفة أسية متعددة ، وإنشاء وظيفة مرتفعة على الفور تتحلل أحاديا بشكل كبير وفقا لهذه الوظيفة والتي تصف بشكل أفضل مرحلة الاضمحلال لتيار الناقل المسجل عند 10 ميكرومولار TBOA. بعد ذلك ، قم بتفويض الوظيفة الأسية الأحادية من ملاءمة تيار الناقل المسجل في 10 ميكرومولار TBOA لاشتقاق المرشح. ثم قم بتفويض المرشح من ملاءمة تيار الناقل في ظروف خاضعة للرقابة.

للحصول على تقدير كمي للمسار الزمني الكلي لإزالة الغلوتامات ، احسب OID لشكل الموجة أثناء محاولة هذا الإجراء. من المهم التأكد من أن حدوث النقل يتم تسجيله في ظل ظروف تجريبية حيث يعمل المرشاح في نظام خطي ويقدم فقط التشوهات الخطية للنقل. يمكن إجراء الموجة الحالية من هذه عن طريق التحقق من التلاعبات التي تغير حجم تيار النقل.

لا تغير مسار الطوابع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام التسجيلات النجمية لاستخراج معلومات حول الغلوتامات والانتشار والامتصاص في الدماغ.