مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخراج بروتينات الخميرة مع الحفاظ على الهيكل الأصلي وتفاعلات الوظائف والتعديلات اللاحقة للترجمة. يتم تحقيق ذلك عن طريق الخلايا الأولى النامية للحث على التعبير عن البروتين محل الاهتمام. بعد ذلك ، يتم تجانس خلايا الخميرة المحصودة في مخزن مؤقت مناسب لاستخراج البروتينات.

ثم يتم تنقية البروتينات ذات الأهمية من مستخلص الخلية الكاملة المصفى باستخدام تقارب من الراتنج. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في مراوغة البروتينات المنقاة من راتنج التقارب لمزيد من التحليل أو التطبيقات النهائية. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تعديلات وتفاعلات تنقية البروتين بناء على تحليل اللطخة الغربية.

سيظهر الإجراء إيفا كي ، خريج ويليام وماري الذي أمضى العامين الماضيين كباحث جامعي في مختبري. الميزة الرئيسية لزخرفة الخرز على الطرق الأخرى الحالية هي المعالجة السريعة والتحلل لعينات متعددة في ظل ظروف تحافظ على تفاعلات وظيفة البروتين وتعديلات ما بعد الترجمة. للبدء في تحويل خلايا سلالة الخميرة الإيجابية مع بلازميد يشفر ستة محفز للجالاكتوز ، يقوم البروتين المفضل لديه بتلقيح المحولات في خمسة ملليلتر من الوسط الانتقائي المناسب مثل SD uracil ، الذي يحتوي على 2٪ سكروز ويحتضن عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الدوران في اليوم التالي ، قم بتخفيف الثقافة الليلية في وسط انتقائي مع 2٪ سكروز إلى حجم نهائي يبلغ 33 مليلتر بحيث تكون الكثافة الضوئية عند 600 قياس النانومتر 0.3 ، وتنمو في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة.

عندما تصل المزرعة إلى OD 600 من 0.8 إلى 1.5 ، قم بتحفيز التعبير عن البروتين المطلوب عن طريق إضافة 17 مل من ثلاثة XYEP مع 6٪ galactose للتركيز النهائي ل XYEP واحد مع وضع 2٪ galactose في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية لمدة خمس إلى ست ساعات إضافية. بعد قياس OD 600 من جهاز الطرد المركزي المستحث حوالي 150 إلى 200 OD 600 وحدة من الخلايا لمدة خمس دقائق عند 5 ، 000 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية ، ثم استخدم ملليلتر واحد من الثلج البارد XPBS مع كوكتيل مثبط البروتياز x لإعادة تعليق حنك الخلية ونقله إلى أنبوب أنبوب غطاء لولبي بملليلتر للطرد المركزي للخلايا لمدة دقيقة واحدة في الساعة 15 ، 000 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية. بعد صب المفاجئة الطافية ، قم بتجميد حبيبات الخلية في النيتروجين السائل إلى حبيبات الخلية المجمدة.

أضف 200 ميكرولتر من الخرز الزجاجي المغسول بالحمض و 500 ميكرولتر من محلول تحلل الجليد. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات. استخدم طرف الماصة مع القطع النهائي لتحريك الماصة لفترة وجيزة لأعلى ولأسفل عند أربع درجات مئوية.

ضع أنابيب الخلايا في قفل توازن مطحنة الخرزة وقم بتشغيل الماكينة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمدة 20 ثانية بسرعة 5.5 متر في الثانية. ثم ضع الأنابيب على الثلج السلاش لمدة دقيقة واحدة. كرر ما مجموعه ست مرات لمسح أجهزة الطرد المركزي للبروتينات المستخرجة لمدة 15 دقيقة عند 15,000 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية.

ثم لتحضير عينة من مستخلص الخلية بأكملها أو WCE للبقعة الغربية و WCE المقابلة لوحدتين OD 600 من الخلايا إلى 800 ميكرولتر من 20٪ حمض ثلاثي كلورو أسيتيك أو دوامة TCA للخلط. لتنقية عينة من WCE الشفاف عند 50 إلى 100 ميكرولتر من راتنج التقارب إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد ، اغسل الراتنج وقم بموازنة الراتنج عن طريق إضافة مليلتر واحد من محلول الغسيل وعكس الجزء العلوي فوق الأسفل حتى يتم إعادة تعليق الراتنج. بعد الدوران لمدة دقيقة واحدة عند 5،000 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية ، استنشق المادة الطافية لربط البروتين لتنقية التقارب عند 100 إلى 200 ميكرولتر من المحللة المقاصة إلى الخرزات المغسولة واستخدم المخزن المؤقت للتحلل ليصل الحجم الإجمالي إلى مليلتر واحد.

احتضان مع الطفرة أو التأرجح عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين إلى خمس ساعات. استخدم النيتروجين السائل لالتقاط كميات متجمدة من WCE الصافي المتبقي وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام الإضافي ، بينما يحتضن محلول البنجر المحلل لعينة WCE Western Blot على الجليد. بعد الدوران لمدة دقيقتين ونصف عند 15 ، 000 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية ، قم بصب المادة الطافية مع الحرص على الاحتفاظ بالحبيبات ، أضف 800 ميكرولتر من 2٪ TCA إلى الحبيبات ودوامة الأنبوب قبل تكرار الدوران لمدة دقيقتين ونصف.

بعد صب المادة الطافية بعناية ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة TCA والدوامة لإذابة الحبيبات قبل احتضان العينة. في كتلة حرارية 100 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق يستغرق مرة ثانية لإذابة أي بقايا من الحبيبات تماما ، والتي قد يكون من الصعب إذابتها وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للاستخدام. بمجرد تحضين عينة حبة المحللة ، بعد الدوران عند 5 ، 000 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة ، استخدم عازلة الغسيل لغسل الراتنج خمس مرات لتصفية البروتينات.

أضف 150 ميكرولترا من محلول الشطف إلى الراتنج عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تدور لمدة دقيقة واحدة عند 5,000 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية وحفظ المادة الطافية في أنبوب جديد. أخيرا ، لتحضير عينة للبقعة الغربية عند 25 ميكرولترا من عينة عينة من كبريتات الليثيوم مع ميكرولترين من BME إلى 25 ميكرولترا من عينة بروتين UD.

كما هو موضح في هذا الشكل ، يمكن استخراج مجموعة واسعة من البروتينات بشكل متكرر من خلايا الخميرة. تدل النطاقات المنفصلة على مجموعة من الأوزان الجزيئية على مستخلصات البروتين عالية الجودة. يمكن تأكيد جودة المستخلصات عن طريق النشاف الغربي لبروتينات معينة تحمل علامة حاتمة.

فيما يلي نتيجة تمثيلية للجالاكتوز المبالغ فيه V خمسة الموسومة Sumo Ligase هي التي تهاجر عند حوالي 120 كيلودالتون. بشكل عام ، تعمل البروتينات المتدهورة جزئيا على شكل أجزاء متعددة أقل من الوزن المتوقع ، ولكن هنا يتم ملاحظة البروتين كامل الطول فقط. بالإضافة إلى ذلك ، قد تشير إضافات الوزن الجزيئي العالي لبروتين معين إلى تعديلات ما بعد الترجمة.

على سبيل المثال ، هنا يمكنك رؤية اللاكتوز فوق السومو المعبر عنه S واحد دلتا أربعة 40 و SIS واحد كامل الطول. كما هو موضح في هذه اللطخة الغربية ، يمكن أيضا الحفاظ على التعديلات على S واحد المعبر عنها داخليا. يوضح هذا الشكل أن اثنين من البروتينات المخصبة نووية SLX five و CS واحدة دلتا أربعة 40 تم تنقيتها بنجاح من ws لدينا.

والجدير بالذكر أن البروتين الذي يحمل علامة ستة هسهسة يمكن تنقية التقارب من W'S ، سواء في ظل الظروف الأصلية أو المتغيرة. في المقابل ، تفتقر SLX 5G ST و CS دلتا واحدة 40 هكتارا إلى ستة حاتمة هسهسة ، ولكن في ظل الظروف الأصلية لا تزال تتفاعل مع راتنج التقارب المعدني بطريقة حساسة. نقترح أن رابطة الدول المستقلة واحد وبدرجة أقل SLX خمسة قادرون على ربط راتنج التقارب المعدني عبر مجال حلقة التنسيق المعدنية.

بينما على حد علمنا ، لم يتم الإبلاغ عن هذه الظاهرة بالذات بعد ، فقد تم وصف موقف مماثل حيث تربط الوحدة الفرعية لتوكسين الكول B راتنج تقارب نيكولا بطريقة تتوسط بقايا الهيستامين الطبيعية. تشير هذه الملاحظة إلى أن البروتينات في WCER ، على الأقل جزئيا ، مطوية أصلا لدراسة وظيفة البروتين. من المهم إظهار أن مجمعات البروتين تظل سليمة في مستخلصات الخلايا الكاملة.

كشفت بيانات تمثيلية أن CS واحد دلتا أربعة 40 SLX خمسة ، و P GK واحد ، وهو بروتين العصارة الخلوية الذي يعمل كعنصر تحكم في التحميل ، كان موجودا في WS cis one. تم تنقية دلتا فور 40 من هذه المستخلصات بناء على قدرتها المتأصلة على الارتباط براتنجات التقارب المعدني. بالإضافة إلى ذلك ، عندما تم التعبير المشترك عن SLX five و SIS one في خلايا الخميرة ، تمت زيادة مستويات SLX الخمسة في EITs مما يزيد من احتمال تفاعل SLX five مع SIS واحد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نمو خلايا الخميرة ومعالجتها من أجل استخراج وتنقية وتصور بروتينات الخميرة في ظل الظروف المحلية.