V3 سير العمل خالية من وصمة عار لمراقبة عملية ومريحة وموثوق بها مجموع البروتين تحميل في النشاف الغربية

يوفر BioRad V three Workflow للباحثين كمية أكثر موثوقية وثقة في عملية النشاف الغربية. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخدام المواد الهلامية الخالية من البقع TGX أولا لفصل عينات البروتين وتصورها. بعد الفصل ، يتم نقل البروتينات إلى غشاء باستخدام نظام النقل السريع التوربيني ، والذي يسمح بالتحقق من جودة النقل وكفاءته.

بعد التحقق من النقل ، يتم حظر الغشاء وفحصه بالأجسام المضادة الأولية والثانوية للبروتينات المستهدفة. أخيرا ، يتم تطبيع مستويات البروتين المستهدفة باستخدام قياس البروتين الكلي الخالي من البقع كعنصر تحكم في التحميل. يوفر سير العمل V three الراحة والشفافية لعملية النشاف الغربي ، مما يوفر للباحثين الثقة في كل خطوة من الفصل إلى النقل والكمية.

تتمثل الميزة الرئيسية لسير عمل V three Western على النشاف الغربي التقليدي في أن التكنولوجيا الخالية من البقع توفر تحكما عمليا ومريحا وموثوقا في تحميل البروتين الكلي لتطبيع إشارات البروتين المستهدفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بموثوقية منهجيات التحكم في التحميل لتقنية النشاف الغربية التي تنطوي على التشبع المفرط لإشارات بروتين التدبير المنزلي ومستويات التعبير التفاضلي لبروتينات التدبير المنزلي في ظل ظروف تجريبية مختلفة. اكتشفنا أنه يمكن أيضا تصور البروتينات المنشطة في المواد الهلامية الخالية من البقع على blos دون مزيد من التلوين ، مما يسمح باستخدامها كبديل لبقع البروتين الكلية التقليدية ، بالإضافة إلى أدوات التحكم في تحميل البروتين المنزلي.

في الدقائق القليلة القادمة ، سنوضح سير العمل الكامل V Three باستخدام مضان متعدد الإرسال. يمكن أيضا استخدام نفس الإجراء للتلألؤ الكيميائي بعد تحضير عينات البروتين وفقا لبروتوكول النص. باستخدام معيار TGX خال من البقع أي جل مسبقة الصب KD ، قم بإزالة المشط والشريط من أسفل الكاسيت.

ضع الكاسيت في جهاز الجل واملأ كلا الخزانين بمخازن مؤقتة قيد التشغيل. قم بتحميل معايير البروتين والعينات. ثم قم بتشغيل الجل لمدة 20 دقيقة عند 300 فولت.

بعد اكتمال الرحلان الكهربائي، استخدم أداة فتح علبة الجل الموجودة على غطاء خلية المعيار لفتح الدرج. ثم ضع بضعة ملليلترات من الماء على محول الأشعة فوق البنفسجية لجهاز تصوير Chemi Dock MP. ارفع الجل بعناية من الكاسيت وضعه على برنامج UV Trans Illuminator Launch Image Lab وقم بإعداد بروتوكول جديد أحادي القناة للمواد الهلامية الخالية من البقع باستخدام وقت تنشيط الجل الافتراضي لمدة دقيقة واحدة ، وحدد نوع الجل المناسب والتحسين التلقائي الافتراضي للأشرطة المكثفة.

ثم انقر فوق تشغيل البروتوكول. بمجرد اكتمال التقاط الصورة ، تصور الفصل وجودة العينة. ثم انتقل على الفور إلى خطوة النقل.

لإجراء نقل البروتين ، افتح حزمة نقل توربو MIDI PVDF عبر الكتلة. ضع المكدس السفلي في وسط قاعدة الكاسيت. قم بإزالة الجل من جهاز التصوير.

قم بمحاذاة الجل أعلى الغشاء. استخدم بكرة اللطخة برفق لإزالة فقاعات الهواء بين الجل والغشاء. بعد ذلك ، قم بمحاذاة المكدس العلوي أعلى الجل.

بعد إزالة أي فقاعات هواء ، ضع غطاء الكاسيت على القاعدة. اضغط على الغطاء لأسفل بإحكام ، وأدر القرص في اتجاه عقارب الساعة لقفل الدرج وإدخاله في أحد فتحتي النشاف. من الشاشة الرئيسية ، حدد بروتوكول turbo.

اختر اثنين من الجل الصغير أو جل صغير واحد ، واضغط على زر التشغيل للحصول على الخليج المناسب. سيكتمل النقل في غضون سبع دقائق. قم بإزالة الكاسيت من الخليج.

افتح الكاسيت وقم بتفكيك شطيرة النشاف. ضع جل ما بعد النقل على جهاز الأشعة فوق البنفسجية لجهاز تصوير Chemi dock MP ، وضع الغشاء على الفور في الماء منزوع الأيونات. قم بإعداد بروتوكول جديد أحادي القناة للمواد الهلامية الخالية من البقع دون وقت تفعيل.

حدد نوع الجل المناسب واضبط وقت التعرض يدويا على وقت هلام النقل المسبق وانقر فوق بروتوكول التشغيل. بمجرد اكتمال التقاط الصورة. تحقق من كفاءة النقل من خلال مقارنة شدة نطاق العينة بين المواد الهلامية قبل وبعد النقل.

قم بإزالة الجل من صينية العينات حيث لم تعد هناك حاجة إليه وتخلص منه. للتحقق ، انقل إلى اللطخة. ضع الغشاء على درج العينة وقم بإعداد بروتوكول قناة واحدة جديد.

لبقعة خالية من البقع. حدد نوع الجل المناسب والتحسين التلقائي الافتراضي للأشرطة المكثفة. ثم انقر فوق تشغيل البروتوكول.

بمجرد اكتمال التقاط الصورة ، تحقق من النقل إلى الغشاء. قم بإزالة غشاء اللطخة من مصباح الأشعة فوق البنفسجية العابر وضعه في مخزن مؤقت مانع للنشاف الغربي. بعد احتضان الغشاء في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، قم باحتضانه بالأجسام المضادة الأولية للفئران والأرانب طوال الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي.

اسكب محلول الأجسام المضادة واستخدم 50 مل من TBST لغسل اللطخة لمدة خمس دقائق. احتضان اللطخة بالأجسام المضادة الثانوية المترافقة الفلورية والمضادة للأرانب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم استخدم TBST لغسل اللطخة خمس مرات لمدة خمس دقائق لكل منها.

لتصوير اللطخة ، ضعها على مصباح الأشعة فوق البنفسجية العابر لجهاز تصوير Chemi doc MP في برنامج مختبر الصور. قم بإعداد بروتوكول جديد متعدد القنوات. قم بتكوين القناة الأولى عن طريق تحديد ستة 50 تحت تطبيقات اللطخة واستخدام التحسين التلقائي الافتراضي للنطاقات المكثفة.

كرر هذه الخطوات لتكوين القناتين الثانية والثالثة ل DITE 5 و 49 و imp free blot على التوالي. حدد نوع الجل المناسب وانقر فوق بروتوكول التشغيل. لتحديد الممرات ، حدد حارة وشرائط الصورة الخالية من البقع.

ثم الباحث عن المسار التلقائي للحصول على كمية دقيقة. تأكد من أن ملفات تعريف الخلفية في كل حارة عينة متشابهة عن طريق ضبط حجم القرص الدوار إلى 70. تأكد من توحيد الخلفية عن طريق المسح الضوئي من خلال جميع ملفات تعريف المسار لتحديد النطاقات في كل من القنوات الست 50 و 5 49.

استخدم أداة البحث عن النطاق لاكتشاف النطاقات باستخدام إعدادات الحساسية الافتراضية. لتعيين قناة التسوية، ارجع إلى مربع أدوات التحليل. انقر فوق التطبيع واختر بقعة خالية من البقع ، مما يضمن تحديد بروتين المسار الكلي.

لتعيين الممرات القياسية للوزن الجزيئي للعودة إلى مربع أدوات التحليل ، انقر فوق أدوات تحليل MW وحدد المربع الموجود أسفل المسار المناسب. أخيرا ، لعرض شدة نطاق البروتين الطبيعي ، انقر فوق جدول التحليل في شريط الأدوات. سيقوم البرنامج تلقائيا بإنشاء جدول يحتوي على شدة الحجم وعوامل التطبيع ووحدات التخزين الطبيعية.

يجب استخدام الأحجام المعيارية لتحليل البيانات وإعداد التقارير. يمكن تصدير الجدول. لمزيد من التحليل ، أظهرنا سير عمل V three Western blotting الكامل.

الآن سوف نعرض لك نتائج تمثيلية من تجربة حقيقية. تم تحليل تحلل مزارع خلايا الخلايا الليمفاوية المضبوطة للتحكم والإشعاع باستخدام سير عمل Vthree Western blot. تظهر إشارة البروتين الكلي الخالية من البقع باللون الأزرق.

يظهر البروتين المستهدف M CM seven باللون الأحمر ، ويظهر التحكم في تحميل بروتين التدبير المنزلي GA DH الذي تم التحقق من صحته باللون الأخضر. تم التحقق من صحة GA DH كعنصر تحكم مناسب في التحميل من خلال تقييم خطيته باستخدام الظروف التجريبية الموضحة في هذا الفيديو. تم قياس إشارات البروتين الكلية الخالية من البقع لكل حارة على اللطخة باستخدام برنامج مختبر الصور.

تم تطبيع شدة إشارة MCM السبع باستخدام كل من إشارات البروتين الكلي و GA DH. كشفت أحجام نطاق البروتين السبعة MCM التي تم تطبيعها بواسطة كلتا الطريقتين عن انخفاض مستويات التعبير بنسبة 25٪ في العينات المشعة مقارنة بعينات التحكم قبل التطبيع الدقيق. يتطلب بروتين التدبير المنزلي التحقق من الصحة لتأكيد نطاقه الخطي ومستويات التعبير المتسقة بين العينات دون التحقق من الصحة.

تضمن أدوات التحكم في تحميل بروتين التدبير المنزلي تطبيعا دقيقا. على النقيض من ذلك ، لا يتطلب تطبيع البروتين الكلي التحقق من الصحة. وبالتالي ، فإن إشارة البروتين الكلية الخالية من البقع التي تم الحصول عليها بواسطة سير عمل V three توفر تحكما عمليا ومريحا وأكثر موثوقية في التحميل أثناء محاولة هذا الإجراء.

تذكر أن التكنولوجيا الخالية من البقع تسمح بالتصور الفلوري لعينات البروتين من خلال تعديل تساهمي ناتج عن الأشعة فوق البنفسجية لبقايا التربتوفان المتاحة. فقط في حالات نادرة ، سيؤثر هذا التعديل بشكل كبير على التطبيقات النهائية مثل الكشف عن المناعة أو قياس الطيف الكتلي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية أداء سير عمل V three Western وتطبيع البروتين الكلي الخالي من البقع.

على الرغم من أننا أظهرنا سير العمل هذا للنشاف الغربي الفلوري متعدد الإرسال ، إلا أنه يمكن أيضا استخدام تقنية خالية من البقع لتطبيع البروتين الكلي مع البقع الغربية المضيئة.