على المدى الطويل المزمن

الهدف العام من هذا الإجراء هو إحداث عدوى مزمنة ومستمرة وطويلة الأمد في المسالك الهوائية للفئران باستخدام بكتيريا pseudomonas aerogen. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استزراع سلالة pseudomonas aerogen البكتيرية المختارة. وتتمثل الخطوة الثانية في دمج البكتيريا داخل حبيبات آجار صغيرة من خلال خلط البكتيريا مع الآجار والزيت المعدني عند 50 درجة Celsius، ثم تبريد الخليط عند 4 درجة Celsius مع التقليب المستمر والبطيء.

بعد ذلك، يتم إزالة الزيت المعدني عن طريق عدة غسلات بمحلول PBS، ثم يتم تجنيس جزء من حبيبات الآجار ونشره على أطباق الآجار. ولتحديد المحتوى البكتيري، تتمثل الخطوة النهائية في حقن بضعة ميكرولترات من معلق حبيبات الآجار في رغامى الفئران لإحداث عدوى رئوية مزمنة ببكتيريا pseudomonas aerogen. وفي النهاية، يمكن استعادة سائل غسيل القصبات والأسناخ والرئتين في نقاط زمنية مختلفة من وقت التحدي ونشرها على أطباق الآجار للكشف عن نسبة الفئران المصابة بشكل مزمن والحمل البكتيري في الممرات الهوائية للفئران الناجية. وتتمثل الميزة الرئيسية لطرق حبيبات الآجار هذه مقارنة بالطرق الحالية في أنها تتيح عدوى مزمنة مستقرة وطويلة الأمد في نسبة عالية من الفئران، مما يؤدي إلى استمرار حمل بكتيري مستقر لمدة تصل إلى شهر واحد.

توفر طرق Agar-agar bead في رئتي الفأر ظروفاً هوائية دقيقة تسمح للبكتيريا بالنمو على شكل مستعمرات دقيقة. وبشكل مشابه للنمو في مخاط مرضى التليف الكيسي، يمكن لهذه الطرق أن تساعد الباحثين في معالجة الأسئلة الرئيسية حول مسببات التليف الكيسي وغيرها من الأمراض التنفسية، واختبار علاجات جديدة ضد Pseudomonas aeruginosa المسببة للعدوى الرئوية المزمنة. كما يمكن استخدام هذه الطرق لتحقيق عدوى مزمنة بمسببات أمراض أخرى، بما في ذلك Burkholderia cepacia أو Staphylococcus aureus، أو العدوى المشتركة بمسببات أمراض مختلفة، أو إجراء تجارب التنافس، مما يثبت فاعلية هذا الإجراء. سيقوم كل من فينو، باحث ما بعد الدكتوراه، وكاميل ريفا، طالب دكتوراه في مختبري، بتنفيذ الخطوات التالية: قبل ثلاثة أيام من تحدي الفأر، قم بتلقيح طبق Tryptic Soy Agar بعروة كاملة من Pseudomonas aeruginosa من المزرعة المخزنة عند -80 °C، ثم حضنها عند 37 °C طوال الليل.

في اليوم التالي، اختر مستعمرة واحدة وقم بتلقيحها في 5 mL من مرق صويا تريبتون (tryptone soy broth)، ثم حضنها عند 37 °C طوال الليل في حاضنة هزازة بسرعة 200 RPM. في صباح اليوم التالي، خفف كمية صغيرة من المزرعة البكتيرية التي تم تحضينها طوال الليل في محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) بنسبة 1:50. بعد ذلك، قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 nm.

بعد ذلك، يتم تخفيف المزرعة البكتيرية التي تم تحضينها طوال الليل عن طريق إضافة وحدتين من الكثافة الضوئية (OD) من المعلق البكتيري في أنبوب جديد يحتوي على 20 milliliters من وسط TSB الطازج، ثم تحضينها عند 37 degrees Celsius لمدة تتراوح بين ثلاث إلى أربع ساعات تقريباً للوصول إلى طور النمو اللوغاريتمي في حاضنة هزازة بسرعة 200 RPM حتى يتم الوصول إلى كثافة ضوئية إجمالية تتراوح من 10 إلى 50 OD. وبمجرد وصول بكتيريا *pseudomonas aerosa* إلى الطور اللوغاريتمي، تُجمع الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي بسرعة 2,700 ×g لمدة 15 minutes عند درجة حرارة 4 degrees Celsius، ثم يتم التخلص من السائل الطافي. بعد ذلك.

أعد تعليق الراسب البكتيري في 1 mL من محلول PBS المعقم واستخدم جهاز الـ vortex جيداً لضمان إعادة تعليقه بالكامل. بعد ذلك، اخلط 1 mL من المعلق البكتيري مع 9 mL من وسط TSA السائل الذي تمت موازنته مسبقاً عند درجة حرارة 50 °C. أضف هذا المزيج إلى الزيت المعدني الثقيل المسخن مسبقاً عند درجة حرارة 50 °C.

قم بالتقليب فوراً لمدة ست دقائق في درجة حرارة الغرفة. يجب أن يؤدي التقليب إلى تكوين دوامة مرئية في الزيت. بعد ذلك، يتم تبريد الخليط إلى 4 °C، مع التقليب بأدنى سرعة لمدة 35 دقيقة.

بعد ذلك، تُترك في الثلج لمدة 20 دقيقة إضافية. ومن ثم، تُنقل حبيبات الآجار إلى أنابيب فالكون سعة 50 milliliter وتُفصل بجهاز الطرد المركزي بسرعة 2,700 ×g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

قم بإزالة الزيت المعدني بدقة واغسل كتلة حبيبات الآجار باستخدام PBS معقم. كرر هذه العملية ست مرات بعد إجراء ثلاث غسلات. يمكن ترسيب الحبيبات بفعل الجاذبية بدلاً من استخدام جهاز الطرد المركزي بعد الغسلة الأخيرة.

أعد تعليق حبيبات الآجار في 20 إلى 30 ميليلتر من PBS، وقم بتجانس 0.5 ميليلتر من الحبيبات بطريقة معقمة. بعد ذلك، خفف 100 ميكروليتر من الحبيبات المتجانسة في 900 ميكروليتر من PBS المعقم وبشكل تسلسلي. خفف الحبيبات ست مرات وصولاً إلى 10⁻⁶ بنسبة 1 إلى 10.

بعد ذلك، يتم توزيع التخفيفات المتسلسلة على أطباق TSA بما في ذلك العينة غير المخففة. يتم تخفيف العينة وصولاً إلى 10⁻⁶، ثم تُحضن الأطباق عند 37 °C. يتم قياس قطر الخرزات باستخدام مجهر ضوئي مقلوب في عدة حقول رؤية.

يجب أن يتراوح قطر الخرزات بين 100 و200 ميكرون قبل تحدي الفئران. قم بعدّ عدد الوحدات المكونة للمستعمرات على أطباق TSA من أجل تحديد عدد CFU لكل مليلتر في معلق خرزات الآجار. بعد ذلك، اضبط حجم خرزات الآجار ليكون من 2 إلى 4 × 10⁷ CFU لكل مليلتر للوصول إلى لقاح أمثل يتراوح بين 1 إلى 2 × 10⁶ في 50 µL.

ضع فأراً ذكراً يتراوح عمره بين ستة إلى ثمانية أسابيع، سبق تخديره باستخدام ketamine و xylazine، في وضعية الاستلقاء على الظهر فوق لوحة تدفئة، وقم بتطهير فرائه باستخدام 70%ethanol. اكشف عن الرغامى عن طريق إجراء قطع عمودي في الجلد. بعد ذلك، استخدم ملاقط لفصل العضلات التي تغطي الرغامى.

بعد ذلك، اسحب ما يصل إلى 50 µL من معلق حبيبات الآجار باستخدام حقنة سعة 1 mL. عقب ذلك، قم بإدخال قسطرة في الرغامي وقم بتوصيل الحقنة التي تحتوي على معلق حبيبات الآجار بالقسطرة. اضغط برفق على مكبس الحقنة للسماح بزرع الحبيبات داخل الرئة.

بعد ذلك، أغلق الشق الجراحي باستخدام مشابك الخياطة. في هذه الخطوة، ضع الفأر الذي تم القتل الرحيم له في وضعية الاستلقاء على الظهر وقم بتطهير فرائه باستخدام 70%ethanol.

بعد ذلك، اكشف عن الرغامى والقفص الصدري عن طريق إجراء شق رأسي في الجلد. بعد ذلك، اكشف عن الرئتين عن طريق قطع الحجاب الحاجز. أدخل خيط خياطة تحت الرغامى باستخدام الملقط، ثم قم بتنبيب الرغامى باستخدام قسطرة.

بعد ذلك، اسحب طرفي خيط الغرزة لربط القسطرة بالقصبة الهوائية، مع الحرص على عدم ربط الخيط حول القصبة الهوائية نفسها. الآن، اسحب 1 mL من وسط زراعة الخلايا باستخدام محقنة سعة 1 mL وقم بتوصيلها بالقسطرة. اضغط على مكبس المحقنة لغسل الرئتين، ثم استعد السائل فوراً واحفظه في أنبوب سعة 15 mL.

كرر هذه الخطوة ثلاث مرات باستخدام إجمالي ثلاثة ملليلتر من الوسط، ثم احفظ سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية على الثلج من أجل جمع الرئتين وتحليلهما. استأصل الرئتين من الفأر، ثم اشطفهما في PBS معقم.

ثم افصل الفصوص. ضعها في أنبوب ذو قاع مستدير يحتوي على 2 mL من محلول PBS المعقم واحفظها على الثلج. قم بتجنيس الرئتين بطريقة معقمة وبشكل متسلسل.

خفف المتجانس في محلول PBS بنسبة 1 إلى 10. بعد ذلك، قم بنشر التخفيفات المتسلسلة، بما في ذلك العينة غير المخففة، على أطباق TSA واحضنها عند 37 درجة مئوية طوال الليل. استخرج سائل BAL من الثلج وخففه بمحلول Turk بنسبة 1 إلى 2 تحت مجهر ضوئي بصري مقلوب.

لحساب العدد الإجمالي للخلايا في غرفة عد بوكر (Burker cell count chamber) من أجل عد الخلايا التفريقي، قم بطرد سائل غسيل القصبات والأسناخ (BAL) مركزياً عند 330 ×g لمدة ثماني دقائق عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب بتركيز 1 مليون خلية لكل mL في وسط زراعة خلايا يحتوي على 10% fetal bovine serum. ضع شرائح المجهر والمرشحات في الفتحات المناسبة في جهاز الطرد المركزي للخلايا (cyto spin) بحيث تكون المرشحات الورقية مواجهة لمركزه.

انقل 150 µL من كل عينة إلى الآبار المناسبة في جهاز السيتوسبين (cytospin)، ثم قم بالطرد المركزي باستخدام جهاز centrifuge السيتوسبين عند 300 ×g لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يجب ملاحظة بقعة من الخلايا، وبعد صبغ هذه البقعة يمكن إجراء العد التفريقي باستخدام المجهر. يوضح هذا الشكل المخطط الزمني للإصابة المزمنة بـ Pseudomonas aerogen باستخدام السلالة المرجعية PA oh one وRP 73.

السلالة السريرية لكل نقطة زمنية. تمثل المخططات البيانية النسبة المئوية للوفيات الناجمة عن تجرثم الدم باللون الأحمر والبقاء على قيد الحياة باللون الرمادي، أو النسبة المئوية للحيوانات التي تخلصت من العدوى باللون الأبيض، وتلك القادرة على إقامة عدوى مزمنة باللون الأخضر. وتعتبر السلالة السريرية pseudomonas aerogen RP 73 أكثر كفاءة في إقامة عدوى مزمنة مقارنة بالسلالة المختبرية PA oh one.

تم القتل الرحيم للفئران الناجية في النقاط الزمنية المحددة وتم استئصال الرئتين، ثم جرى عمل تجانس للأنسجة وزراعتها على أطباق TSA لتحديد الحمل البكتيري. تُظهر منحنيات نمو سلالتي P oh one وRP 73 في رئتي الفئران أن كمية البكتيريا بعد ثلاثة أيام من العدوى تكون أعلى في سلالة P oh one مقارنة بسلالة RP 73. ومن ثم، بدءاً من اليوم السابع عند استقرار العدوى المزمنة، يستقر الحمل البكتيري ما بين 10⁴ و10⁵ CFU لكل رئة لكلتا السلالتين؛ وبعد سبعة أيام من العدوى المزمنة بالسلالة السريرية RP 73، تم تقييم استقطاب الخلايا الالتهابية في سائل غسيل القصبات والأسناخ (BAL).

يكون العدد الإجمالي لكريات الدم البيضاء أعلى بكثير في الفئران المصابة بـ RP 73 مقارنة بالفئران غير المصابة. وتعتبر الخلايا المتعادلة هي الأكثر تمثيلاً، مما يشير إلى استجابة ملحوظة من الجهاز المناعي الفطري للعدوى المزمنة. في المربع أدناه، تشير الأسهم إلى الخلايا المتعادلة وخلية بلعمية كما تظهر في بقعة على شريحة بعد عملية الطرد المركزي الخلوي (cyto spin).

يظهر هنا صبغ الهيماتوكسيلين والإيوزين على مقاطع نسيجية لرئات الفئران بعد سبعة أيام من العدوى المزمنة بالسلالة السريرية rp. 73، حيث يمكن ملاحظة حبيبات يشار إليها بالأسهم في تجويف القصبات ومستعمرات دقيقة من الخلايا البكتيرية. وفي المناطق المصابة، تتميز القصبات والبرنشيمة الرئوية بتجنيد هائل للخلايا الالتهابية.

بينما كانت المجاري التنفسية للفأر غير المصاب خالية من الخلايا الالتهابية، فإن القطر والتركيز النهائي لـ BES يعدان تفاصيل بالغة الأهمية. ولتحقيق نتيجة جيدة، من المهم تذكر أن حجم الخرز يتأثر بمعدل التحريك خلال مرحلة التبريد، وأن الكمية الأولية من البكتيريا يمكن أن تؤثر على التخفيف النهائي للخرز. علاوة على ذلك، فإن اختيار سلالة مناسبة من pseudomona، والتي تسبب معدل وفيات منخفض لدى الفئران ونسبة عالية من العدوى المزمنة، سيقلل من عدد الفئران المستخدمة.

بعد إصابة الفئران، يتم إجراء تعداد بكتيري. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تحليل للاستجابة الالتهابية من حيث التعداد الخلوي الكلي والتفاضلي في السائل القصبي، وتحليل السيتوكينات في السائل، ومقايسة الميلوبيروكسيديز، والتحليل النسيجي، وذلك لدراسة استجابة القرحة للعدوى البكتيرية. لا تنسَ أن العمل مع الممرضات الانتهازية مثل Pseudomonas يمكن أن يكون خطيراً، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات والتطبيقات اللازمة دائماً، مثل ارتداء القفازات، والتعامل مع البكتيريا داخل كابينة السلامة البيولوجية، واستخدام التقنيات المعقمة.

سمح تطوير نماذج حيوانية مناسبة بإجراء الاختبارات قبل السريرية لجزيئات جديدة مضادة للبكتيريا ومضادة للالتهابات. وتعد هذه خطوة هامة للتدخلات العلاجية المستقبلية لعلاج عدوى الرئة لدى المرضى المصابين بالتليف الكيسي أو أمراض تنفسية أخرى.