إعداد بسيط ضوء مجهر ورقة ل في توتو التصوير من C. ايليجانس التنمية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير تطور C Allergan باستخدام الفحص المجهري للورقة الضوئية الفلورية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد المجهر القائم على الصفائح الضوئية أولا المكون من مجهر مستقيم ومجموعة صغيرة من العناصر البصرية الميكانيكية لإنشاء ورقة ضوئية. الخطوة الثانية من الإجراء هي تركيب الجنين.

الخطوات الأخيرة هي ضبط ورقة الضوء على الجنين وتسجيل تطوره. يمكن أن تظهر النتائج ديناميكيات البروتينات المصنفة بالفلورسنت أثناء تطور CL egan من خلال تحليل مقاطع الفيديو ثلاثية الأبعاد والفاصل الزمني. تتمثل المزايا الرئيسية للفحص المجهري للسفينة الخفيفة على الطرق الأخرى الموجودة ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، في أنه يسمح بتصوير أسرع مع سمية ضوئية أقل.

ثالثا ، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للختم ضد التطور. يمكن أيضا تطبيقه على نظام آخر مثل القوس أو الزرد. سيكون توضيح الإجراء واضحا.

شالز مهندس من مختبري وبولين ليناك ، مهندسة من مختبر الشاحنة. يصف هذا القسم تجميع الإعداد، ويمكن تركه مجمعا لجميع التجارب. بمجرد وضع كل من الليزر والمرشحات والتلسكوب والمنظار على الطاولة البصرية ، قم بتأمين العدسة الأسطوانية لتوليد ورقة الضوء.

يتم ضبط عدسة مختلفة للتركيز البؤري. يجب أن تتزامن النقطة المحورية لهدف الإضاءة مع النقطة المحورية للكائن لهدف الكشف. الآن ، قم بإسقاط الشعاع على الحائط أو الشاشة وحرك هدف الإضاءة على طول محور الشعاع حتى تصبح ملامح الإسقاط حادة.

قم بتضمين مرشح انبعاث رباعي الخطوط وكاميرا E-M-C-C-D في إعداد المجهر. قم بإصلاح مرحلة الترجمة اليدوية الثانية إلى الأولى بطريقة عمودية. قم بربط التجميع بمرحلة المجهر الحالية.

بعد إزالة هدف إضاءة العدسة الأسطوانية المحدد ، ضع المجموعة على المجهر وأعد الإضاءة على المراحل. قم بتوصيل حامل qve عند التقاطع العمودي لمسار الإضاءة ومسار الكشف. الآن ، تحقق من ورقة الضوء.

املأ زجاجا بمحلول الفلورسين وضعه في الحامل على المراحل. يجب أن تكون الورقة الضوئية مرئية. يجب أن تكون أفقية ومركزية فيما يتعلق بالعدسة الموضوعية للكشف.

بعد ذلك ، قم بإزالة العدسة الأسطوانية. قم بتحسين ورقة الضوء باستخدام الترجمة ثلاثية الأبعاد لهدف الإضاءة ، واحصل على صورة لقياس سمك ورقة الضوء. هذا يعتمد على فتحة العدسة الموضوعية.

ثم تأكد من استبدال العدسة الأسطوانية. أولا ، قم بقص قطعة من الزجاج بسمك ملليمتر واحد ، 10 ملليمترات × 20 ملم. استخدم قلم الوسم الماسي.

بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من بولي L يسين إلى جانب واحد ، وبمجرد أن يجف ، ضعه جنبا إلى جنب مع شريحة ثانية. في وضع ثابت ، أضف قطرة 5٪ أجار وقم بتنعيمها مع وزن شريحة ثالثة في الأعلى. بعد أن يجف الأجار ، قم بإزالة الشريحة الثالثة وقم بقص وسادة أجار على بعد ثلاثة ملليمترات من حافة الشريحتين المتبقيتين فوق الشريحة بدون بولي L lysine.

ثم قم بإزالة الشريحة الثابتة ، تاركا نتوءا من أجار. قم بتغطية الأجار ب 20 ميكرولتر من بولي إل ليسين واتركه حتى يجف. الآن ضع ديدان GR في زجاج ساعة مملوء بوسط M تسعة تحت مجهر التشريح.

قطع الديدان بمستوى مشرط إلى الفرج ، وبالتالي إطلاق البيض. ثم حدد الأجنة التي هي في مرحلة الاهتمام واجمعها باستخدام ماصة شعرية دقيقة. انقل الأجنة إلى أجار المتدلي من الشريحة المعدة بجوار حافة الشريحة مباشرة ، وليس على حدود الأجار.

ثم قم بمحاذاة الأجنة بماصة شعرية دقيقة أثناء إزالة السائل. عن طريق الشفط ، سوف تلتصق الأجنة بالبوليول ليسين. من المهم جدا وضع الأجنة جيدا للحصول على تسجيل جيد ، وهذا يتطلب شعيرات دموية ذات الملاءمة المناسبة.

إذا كانت صغيرة جدا ، فسيكون من الصعب إطلاق الأجنة. إذا كان كبيرا جدا ، فسيكون من الصعب التحكم بإحكام في التدفق المتسرب ومحاذاة الأجنة ، وقم بتغطية الشريحة بوسط M تسعة في طبق بتري وتأكد من أن الأجنة لا تزال مرتبطة بالأجار باستخدام التكبير. الآن ، قم بإصلاح الشريحة المعدة مع الأجنة على حامل العينة الذي يناسب vete.

الحامل عبارة عن أداة غريبة مصنوعة في المنزل مصممة لتناسب الطبيب البيطري. بعد ذلك ، قم بتأمين vete في مرحلة Pizo الكهربائية وتحت إضاءة المجال الساطع ، حدد موقع الجنين. الآن ابدأ حزمة البرامج التي تتحكم في ضبط البصريات الصوتية.

قم بتصفية الكاميرا والمسرح. تمت كتابة هذا البرنامج هنا داخليا ، ولكن يمكن أيضا استخدام البرامج المجانية micromanager. أولا ، حدد خط الليزر.

بعد ذلك ، اضبط المرحلة على طول المحور x حتى تصبح ورقة الضوء في أفضل حالاتها. ثم اضبط البعدين الآخرين ، Y و Z حتى تصبح الإشارة إلى الضوضاء في أفضل حالاتها. قد يلزم تكرار هذا لكل جنين.

هذا المفتاح لتحسين الإشارة إلى النسبة للحصول على تسجيل جيد يترجم بشكل جيد المرحلة الحرة, دعم الهدف والقضاء عندما أقوم فقط بالحصول على محاكاة ous للجنين وأفضل تباين. احصل الآن على صور الفاصل الزمني ، قم بتعيين التعرض لطاقة الليزر ، وكسب الوقت ، والفاصل الزمني للتصوير وفقا لمستوى التألق للجنين وسرعة العملية البيولوجية التي تم تحليلها. لزاك.

التصوير المسافة بين الشرائح ومواضع البداية والنهاية في c elgan للتعبير عن بنية هيستون GFP. تم إجراء تصوير بفاصل زمني لمدة ساعتين باستخدام 20 مجموعة شرائح تم التقاطها كل 37 ثانية. كانت انقسامات الخلايا مرئية بوضوح في سلالة تعبر عن التوبولين المدمجة في GFP وحجره المدمجة في m الكرز تم أخذ التسجيلات لمدة 16 دقيقة كل 105 ثانية.

يتم عرض العروض ثلاثية الأبعاد في ثلاث نقاط زمنية. يمكن رؤية المغازل الانقسامية والكروموسومات المكثفة بوضوح ويمكن تتبعها بسهولة من خلال انقسامات الخلايا. في سلالة ثالثة من البروتين الدهني APO ، تم تصوير اثنين من المدمجين في GFP باستخدام وضع العلامات على mCherry لغشاء الخلية.

على مدار 13 دقيقة ، تم أخذ 10 مجموعات شرائح كل 27 ثانية. كان من السهل متابعة جزيئات البروتين الدهني سريعة الحركة. هنا نستخدم الصفيحة الخفيفة المكونة من طرق أكثر تعقيدا لإنتاجها.

يمكن تنفيذ الورقة الضوئية لتحسين الدقة المكانية بشكل أكبر.