إعداد بسيط ضوء مجهر ورقة ل في توتو التصوير من C. ايليجانس التنمية
مايو 5, 2014
يصف هذا البروتوكول الإعداد المجهر رقة الضوء وتنفيذها لفي الجسم الحي التصوير من C. ايليجانس الأجنة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير تطور C Allergan باستخدام الفحص المجهري للورقة الضوئية الفلورية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد المجهر القائم على الصفائح الضوئية أولا المكون من مجهر مستقيم ومجموعة صغيرة من العناصر البصرية الميكانيكية لإنشاء ورقة ضوئية. الخطوة الثانية من الإجراء هي تركيب الجنين.
الخطوات الأخيرة هي ضبط ورقة الضوء على الجنين وتسجيل تطوره. يمكن أن تظهر النتائج ديناميكيات البروتينات المصنفة بالفلورسنت أثناء تطور CL egan من خلال تحليل مقاطع الفيديو ثلاثية الأبعاد والفاصل الزمني. تتمثل المزايا الرئيسية للفحص المجهري للسفينة الخفيفة على الطرق الأخرى الموجودة ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، في أنه يسمح بتصوير أسرع مع سمية ضوئية أقل.
ثالثا ، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للختم ضد التطور. يمكن أيضا تطبيقه على نظام آخر مثل القوس أو الزرد. سيكون توضيح الإجراء واضحا.
شالز مهندس من مختبري وبولين ليناك ، مهندسة من مختبر الشاحنة. يصف هذا القسم تجميع الإعداد، ويمكن تركه مجمعا لجميع التجارب. بمجرد وضع كل من الليزر والمرشحات والتلسكوب والمنظار على الطاولة البصرية ، قم بتأمين العدسة الأسطوانية لتوليد ورقة الضوء.
يتم ضبط عدسة مختلفة للتركيز البؤري. يجب أن تتزامن النقطة المحورية لهدف الإضاءة مع النقطة المحورية للكائن لهدف الكشف. الآن ، قم بإسقاط الشعاع على الحائط أو الشاشة وحرك هدف الإضاءة على طول محور الشعاع حتى تصبح ملامح الإسقاط حادة.
قم بتضمين مرشح انبعاث رباعي الخطوط وكاميرا E-M-C-C-D في إعداد المجهر. قم بإصلاح مرحلة الترجمة اليدوية الثانية إلى الأولى بطريقة عمودية. قم بربط التجميع بمرحلة المجهر الحالية.
بعد إزالة هدف إضاءة العدسة الأسطوانية المحدد ، ضع المجموعة على المجهر وأعد الإضاءة على المراحل. قم بتوصيل حامل qve عند التقاطع العمودي لمسار الإضاءة ومسار الكشف. الآن ، تحقق من ورقة الضوء.
املأ زجاجا بمحلول الفلورسين وضعه في الحامل على المراحل. يجب أن تكون الورقة الضوئية مرئية. يجب أن تكون أفقية ومركزية فيما يتعلق بالعدسة الموضوعية للكشف.
بعد ذلك ، قم بإزالة العدسة الأسطوانية. قم بتحسين ورقة الضوء باستخدام الترجمة ثلاثية الأبعاد لهدف الإضاءة ، واحصل على صورة لقياس سمك ورقة الضوء. هذا يعتمد على فتحة العدسة الموضوعية.
ثم تأكد من استبدال العدسة الأسطوانية. أولا ، قم بقص قطعة من الزجاج بسمك ملليمتر واحد ، 10 ملليمترات × 20 ملم. استخدم قلم الوسم الماسي.
بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من بولي L يسين إلى جانب واحد ، وبمجرد أن يجف ، ضعه جنبا إلى جنب مع شريحة ثانية. في وضع ثابت ، أضف قطرة 5٪ أجار وقم بتنعيمها مع وزن شريحة ثالثة في الأعلى. بعد أن يجف الأجار ، قم بإزالة الشريحة الثالثة وقم بقص وسادة أجار على بعد ثلاثة ملليمترات من حافة الشريحتين المتبقيتين فوق الشريحة بدون بولي L lysine.
ثم قم بإزالة الشريحة الثابتة ، تاركا نتوءا من أجار. قم بتغطية الأجار ب 20 ميكرولتر من بولي إل ليسين واتركه حتى يجف. الآن ضع ديدان GR في زجاج ساعة مملوء بوسط M تسعة تحت مجهر التشريح.
قطع الديدان بمستوى مشرط إلى الفرج ، وبالتالي إطلاق البيض. ثم حدد الأجنة التي هي في مرحلة الاهتمام واجمعها باستخدام ماصة شعرية دقيقة. انقل الأجنة إلى أجار المتدلي من الشريحة المعدة بجوار حافة الشريحة مباشرة ، وليس على حدود الأجار.
ثم قم بمحاذاة الأجنة بماصة شعرية دقيقة أثناء إزالة السائل. عن طريق الشفط ، سوف تلتصق الأجنة بالبوليول ليسين. من المهم جدا وضع الأجنة جيدا للحصول على تسجيل جيد ، وهذا يتطلب شعيرات دموية ذات الملاءمة المناسبة.
إذا كانت صغيرة جدا ، فسيكون من الصعب إطلاق الأجنة. إذا كان كبيرا جدا ، فسيكون من الصعب التحكم بإحكام في التدفق المتسرب ومحاذاة الأجنة ، وقم بتغطية الشريحة بوسط M تسعة في طبق بتري وتأكد من أن الأجنة لا تزال مرتبطة بالأجار باستخدام التكبير. الآن ، قم بإصلاح الشريحة المعدة مع الأجنة على حامل العينة الذي يناسب vete.
الحامل عبارة عن أداة غريبة مصنوعة في المنزل مصممة لتناسب الطبيب البيطري. بعد ذلك ، قم بتأمين vete في مرحلة Pizo الكهربائية وتحت إضاءة المجال الساطع ، حدد موقع الجنين. الآن ابدأ حزمة البرامج التي تتحكم في ضبط البصريات الصوتية.
قم بتصفية الكاميرا والمسرح. تمت كتابة هذا البرنامج هنا داخليا ، ولكن يمكن أيضا استخدام البرامج المجانية micromanager. أولا ، حدد خط الليزر.
بعد ذلك ، اضبط المرحلة على طول المحور x حتى تصبح ورقة الضوء في أفضل حالاتها. ثم اضبط البعدين الآخرين ، Y و Z حتى تصبح الإشارة إلى الضوضاء في أفضل حالاتها. قد يلزم تكرار هذا لكل جنين.
هذا المفتاح لتحسين الإشارة إلى النسبة للحصول على تسجيل جيد يترجم بشكل جيد المرحلة الحرة, دعم الهدف والقضاء عندما أقوم فقط بالحصول على محاكاة ous للجنين وأفضل تباين. احصل الآن على صور الفاصل الزمني ، قم بتعيين التعرض لطاقة الليزر ، وكسب الوقت ، والفاصل الزمني للتصوير وفقا لمستوى التألق للجنين وسرعة العملية البيولوجية التي تم تحليلها. لزاك.
حددالتصوير المسافة بين الشرائح ومواضع البداية والنهاية في c elgan للتعبير عن بنية هيستون GFP. تم إجراء تصوير بفاصل زمني لمدة ساعتين باستخدام 20 مجموعة شرائح تم التقاطها كل 37 ثانية. كانت انقسامات الخلايا مرئية بوضوح في سلالة تعبر عن التوبولين المدمجة في GFP وحجره المدمجة في m الكرز تم أخذ التسجيلات لمدة 16 دقيقة كل 105 ثانية.
يتم عرض العروض ثلاثية الأبعاد في ثلاث نقاط زمنية. يمكن رؤية المغازل الانقسامية والكروموسومات المكثفة بوضوح ويمكن تتبعها بسهولة من خلال انقسامات الخلايا. في سلالة ثالثة من البروتين الدهني APO ، تم تصوير اثنين من المدمجين في GFP باستخدام وضع العلامات على mCherry لغشاء الخلية.
على مدار 13 دقيقة ، تم أخذ 10 مجموعات شرائح كل 27 ثانية. كان من السهل متابعة جزيئات البروتين الدهني سريعة الحركة. هنا نستخدم الصفيحة الخفيفة المكونة من طرق أكثر تعقيدا لإنتاجها.
يمكن تنفيذ الورقة الضوئية لتحسين الدقة المكانية بشكل أكبر.
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول إعداد مجهر ورقة الضوء وتنفيذه لتصوير في الجسم الحي لجنين C. elegans. تسمح الطريقة بتصوير أسرع مع سمية ضوئية أقل مقارنة بالتصوير المجهري النفقي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزياء الحيوية
- التصوير المجهري
الخلفية
- يوفر التصوير المجهري بورقة الضوء نهجًا فريدًا لتصوير العينات البيولوجية.
- تعتبر هذه التقنية مفيدة بشكل خاص لمراقبة الأجنة الحية.
- يقلل من الضرر الضوئي بينما يسمح بالتصوير السريع.
- تمتد التطبيقات إلى كائنات نموذجية مختلفة تتجاوز C. elegans.
غرض الدراسة
- تصور تطور أجنة C. elegans باستخدام التصوير المجهري بورقة الضوء الفلورية.
- تحليل ديناميكيات البروتينات الموسومة بالفلورسنت أثناء التطور.
- لتبرير مزايا التصوير المجهري بورقة الضوء على الطرق التقليدية.
الطرق المستخدمة
- إعداد مجهر ورقة الضوء مع العناصر البصرية الميكانيكية.
- تركيب الأجنة على شرائح معدة مع وسادات الأجار.
- تحسين محاذاة ورقة الضوء للتصوير.
- تصوير فواصل زمنية للأجنة لالتقاط العمليات التنموية.
النتائج الرئيسية
- تصوير ناجح لعمليات انقسام الخلايا وديناميكيات البروتينات في أجنة C. elegans.
- تم الحصول على عروض ثلاثية الأبعاد للمغازل الانقسامية والكروموسومات.
- تم البرهنة على القدرة على تتبع البروتينات سريعة الحركة.
- قدمت رؤى حول العمليات التنموية للكائن الحي.
الاستنتاجات
- يعتبر التصوير المجهري بورقة الضوء أداة قوية للتصوير في الجسم الحي.
- تعزز هذه الطريقة فهم تطور الأجنة.
- يمكن تكييفه للاستخدام مع كائنات نموذجية أخرى.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Light sheet microscopy enables high-resolution, low-phototoxicity imaging of whole-organism development, supporting target validation in early discovery by providing quantitative, dynamic phenotypic data. This approach reduces biological uncertainty in preclinical models by allowing longitudinal tracking of cellular processes and protein dynamics in live systems. The method enhances predictive confidence in lead identification by delivering reproducible, scalable imaging outputs compatible with high-content screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through subcellular-resolution visualization of protein dynamics and cell divisions in developing embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible, quantitative readouts of developmental phenotypes under low-phototoxic conditions.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating longitudinal, multi-parameter datasets that correlate molecular perturbations with developmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, 3D time-lapse imaging with subcellular resolution, enabling reliable compound effect assessment in whole-organism contexts.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through precise light sheet alignment and stabilization, minimizing variability in longitudinal imaging sessions.
- Scalability: Compatible with multi-well observation chambers and automated stage control, supporting medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling consistent phenotypic assessment across model systems using standardized imaging protocols.
- Mechanistic De-risking: Allows direct observation of target engagement effects on developmental processes, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative thresholds for go/no-go decisions based on developmental toxicity and phenotypic normalization metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead optimization, offering a non-destructive, quantitative imaging modality for phenotypic screening and mechanistic studies in whole-organism models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time tracking of fluorescently labeled proteins and cellular structures during embryogenesis.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, light sheet characterization, and embryo mounting protocols that ensure imaging consistency.
- Analytics: Generates quantitative 3D and time-lapse readouts (e.g., mitotic spindle dynamics, protein trafficking) that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant phenotypic readouts in C. elegans, a validated model for conserved developmental pathways.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, left-assembled system on an optical table, enabling repeated use across projects with minimal recalibration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, longitudinal observation of protein dynamics and cellular behavior.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized opto-mechanical alignment, slide preparation, and embryo mounting procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of developmental toxicity, reducing late-stage attrition due to unidentified biological risks.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative, imaging-based phenotypic scores that inform advancement decisions across target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, fluorescence microscopy, and sample preparation for live imaging.
- Needs stable optical table, laser sources, objectives, translation stages, and EM-CCD or sCMOS camera for detection.
- Demands cross-team standardization of slide preparation, embryo staging, and imaging parameters to ensure reproducibility across users and sites.
- Adaptation considerations include embryo size, optical clearing, and mounting medium compatibility when extending to other model systems (e.g., zebrafish, Drosophila).
- Practical limitations include embryo immobilization efficiency and light sheet uniformity over large fields of view, which may require optimization for longer imaging sessions.
![الأمعاء C. ايليجانس "كنموذج" ل Morphogenesis التجويف بين الخلايا و في فيفو الاستقطاب نشوء غشاء حيوي على مستوى الخلايا المفردة: وضع العلامات تلطيخ جسم والخسارة [رني] من وظيفة تحليل وتصوير](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56100.jpg%3Fv%3D2026-07-03T23%253A53%253A24.000Z&w=384&q=75)
