Name: إعداد بسيط ضوء مجهر ورقة ل في توتو التصوير من C. ايليجانس التنمية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: تعلم إعداد مجهر الورقة الضوئية لتصوير أجنة C. elegans في توتو. تتيح هذه الطريقة تصويرًا أسرع مع سُمّية ضوئية أقل مقارنة بالمجهر المكافئ، مما يساعد الباحثين على دراسة ديناميكيات البروتينات المُصَوَّرة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر جميع أعضاء Lenne ومختبرات برتراند، ولا سيما اوليفييه بلان لتطوير البرمجيات وجيريمي Capoulade للمناقشة. نشكر أيضا مرفق التصوير PICsL-IBDM، ولا سيما كلود موريتي وبرايس Detailleur للدعم التقني. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من ATIP CNRS (لP.-FL وVB)، وLabex إنفورم منحة (لP.-FL وVB) ومنحة من شركة سانوفي أفنتيس (لVB). نحن نعترف البنية التحتية فرانس BioImaging بدعم من الوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR-10-INSB-04-01، والدعوة &quot;INVESTISSEMENTS كوت أفينير&quot;).

1. إعداد ورقة الضوء والكشف عن مسار يعطي الشكل 1 مخطط العام من الإعداد البصرية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع وإصلاح المجهر وأشعة الليزر على الطاولة البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين الليزر 488 نانومتر، 561 نانومتر و 405 نانومتر مع المرايا مزدوج اللون المطابق. بعد المرايا مزدوج اللون، وأشعة الليزر يجب أن تكون بالضبط شارك الانحياز. لاحظ أن يتم تحديد خيار من موجات الليزر، مرايا مزدوج اللون، والمرشحات الضوئية من أطياف امتصاص التسميات الفلورسنت المحددة المستخدمة في التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مرشح الانضباطي الصوتية البصرية (AOTF). استخدام ورقة الاختبار المقدمة من الموردين لضبط وتيرة وقوة AOTF. عندما تتماشى جيدا، تبث حوالي 90٪ من طاقة الليزر في أقصى ضبط مقاسا powermeter. لاحظ أن بعض أجهزة الليزر يمكن التحكم بالكامل من قبل البرمجيات، والتي يمكن أن تجعل AOTF لا لزوم لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع وإصلاحالتلسكوب. نلاحظ أن المنظار يتكون من اثنين من العدسات التي تعمل على توسيع شعاع لعرض يساوي أو أكبر من قطر الفتحة الخلفية للإضاءة عدسة الهدف. العدسة مع أصغر البؤري ينبغي أن يأتي أولا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان، ومحاذاة إصلاح بيريسكوب جلب صعودا مسار بصري أقرب إلى الفتحة الخلفية للعدسة أسطواني. نلاحظ أن اثنين من المرايا من المنظار هي التي شنت بطريقة المحور الطويل هو زرع على الميل للمرآة لكي تعكس شعاع توسعت بشكل كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عدسة اسطوانية المقبل للخروج المنظار. لاحظ أن عدسة اسطوانية يركز شعاع في اتجاه واحد وتترك موازى في الاتجاه الآخر، وبالتالي تكوين ورقة الخفيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تركيز الورقة الضوء الناتج باستخدام الإضاءة عدسة الهدف. لاحظ أن النقطة المحورية صورة الهدف الإضاءة يجب أن يتزامن مع النقطة المحورية موضوع الكشف عن الهدف. المشروع شعاععلى شاشة (مثل الجدار) على مسافة طويلة. تحرك الهدف الإضاءة على طول محور الإضاءة شعاع للحصول على الشاشة ملامح حادة من ورقة الخفيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع خط رباعية (405/488/561/638) تصفية الانبعاثات في المكان المخصص في المجهر (المكعب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الكاميرا EMCCD في منفذ إخراج المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح أول مرحلة الترجمة دليل على المسرح المجهر بواسطة مسامير في الثقوب المحفورة في المرحلة المجهر. نلاحظ أن حافة مرحلة الترجمة لابد من وضعه في حوالي 2 سم بعيدا عن وسط المسرح المجهر، بحيث يتم توسيط كفيت أدناه كشف عدسة الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الثانية مرحلة الترجمة دليل على أول واحد. توجيهات المرحلتين يجب أن تكون متعامدة (X و Y الترجمات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح المرحلة Z كهرضغطية في الجزء العلوي من اثنين من المراحل السابقة. لاحظ أن مرحلة الآلية يمكن أن تستخدم بدلا من مرحلة كهرضغطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح holde كفيتص (انظر الشكل 2) في الجزء العلوي من المراحل. سيوضعون كفيت عند تقاطع الطريق الإضاءة ومسار الكشف، والتي هي متعامدة مع بعضها البعض. </li></ol> 2. التحقق من ورقة الخفيفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كفيت الزجاج بمحلول فلوري، ووضعه على صاحب العينة عند تقاطع اثنين من المسارات البصرية. ورقة الضوء وبالتالي مرئية. فإنه يجب أن يكون أفقيا، ومتماثل / تركزت فيما يتعلق كشف عدسة الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عدسة اسطوانية والحصول على صورة لقياس سمك الورقة الضوء. لاحظ أن سمك الورقة الضوء يعتمد على الفتحة العددية (NA) من إضاءة عدسة الهدف (حوالي 3-4 ميكرون لNA = 0.3). لاحظ أن عدسة معينة، ويمكن زيادة سمك الورقة للضوء عن طريق الحد من حجم شعاع دخول الفتحة مرة أخرى مع فتحة. نلاحظ أن المجهرية الفلورسنت يمكن استخدامها لقياس الفأسقرار الاتحاد العالمي للتعليم والوحشي المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة وضع عدسة اسطوانية قبل بدء التجربة. </li></ol> 3. وتصاعد من C. ايليجانس الأجنة والصورة الخطوات التالية في الشكل 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قلم علامات الماس لقطع قطعة من شريحة زجاجية من 10 × 20 × 1 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 5٪ bacto أجار في الماء، وأنها تغلي والحفاظ عليه في كتلة سخان في 60 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من بولي-L-يسين على جانب واحد من قطعة من قطع الشريحة، اتركه حتى يجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شريحة المجهر على مقاعد البدلاء وإصلاحه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيجمع قطعة من قطع الشريحة مع الشريحة الثابتة وإضافة قطرة من آغار ذاب على القمة. ضغط على أجار باستخدام شريحة المجهر نظيفة أخرى للحصول على لوحة آغار رقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح لوحة أجار لتجف قبل إزالة الشريحة العليا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع لوحة أجار على جانب من الشريحة ثابتة من أجل ترك وجود فائض من حوالي 3 ملم سو أجار وإزالة بلطف الشريحة الثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من بولي-L-يسين على أجار واتركها تجف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الديدان حامل في M9 المتوسطة في كوب ووتش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الديدان على مستوى الفرج مع مشرط للافراج عن الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت مجهر التعرف على الأجنة في مرحلة الفائدة وجمعها باستخدام ماصة microcapillary. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة من جانب آغار المغلفة مع بولي-L-يسين أن يبرز من قطعة من قطع الشريحة. وضع الأجنة فقط بجانب الحدود من الشريحة. لا وضع الأجنة في حدود أجار لأنها لن تكون مستقرة بما فيه الكفاية. إزالة بلطف السائل بحيث الأجنة ستلتزم على طبقة بولي-L-يسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة بسرعة الأجنة لتجنب الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريحة قطع في طبق بتري البلاستيكية وإضافة بلطف M9 المتوسطة لتغطية الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاختيار تحت مجهر أن البيض لا تزال عالقة على أجار. </لى&gt; </ol> 4. تسجيل من C. التنمية ايليجانس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح إعداد السابقة (قطع الشريحة، بالإضافة إلى أجار الأجنة) في صاحب العينة ووضعها في كوفيت. يصف الشكل 4 حامل محلية الصنع ويبين الشكل 5 إطلالة على كفيت في سياق المراقبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح كفيت على المسرح كهرضغطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقف الأجنة مع إضاءة حقل مشرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء البرنامج الصنع السيطرة على AOTF، والكاميرا والمرحلة كهرضغطية. نلاحظ أن البرمجيات الحرة، مثل micromanager، يمكن أن تستخدم أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد خط ليزر والطاقة (AOTF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الموقف من الورقة الضوء باستخدام المرحلة 3 اتجاهات دعم عدسة اسطوانية وعدسة الإضاءة. نقل المرحلة على طول اتجاه الجانبي (X) للحصول على إشارة ألمع. ضبط ثم موقف Z الورقة الضوء، والموقف الطولي (Y) للحصول على اله أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء. لاحظ أن موقف التركيز رقة ضوء قد تحتاج إلى تعديل من جنين واحد إلى آخر لتصحيح الاختلافات في أطوال مسار الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على صور عالية الفاصل الزمني، حدد وقت التعرض، واكتساب، والوقت بين صورتين، فضلا عن عدد من الصور التي سيتم شراؤها، وقوة الليزر. لاكتساب اللون 2، حدد خط ليزر ثاني. يتم الحصول على اثنين من الصور الملونة على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على كومة من الألف إلى الياء، أيضا تحديد المسافة بين شرائح اثنين، والبداية والنهاية مواقف كهرضغطية. </li></ol>

<ol><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li>
<li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet-based+fluorescence+microscopy%3A+more+dimensions%2C+more+photons%2C+and+less+photodamage%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+J%22%5BJournal%5D)">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li>
<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li>
<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+%28iSPIM%29+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li>
<li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li>
<li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li>
<li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li>
<li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+%28mSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li>
</ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يصف هذا البروتوكول وسهلة الإعداد المجهر ضوء ورقة لفي الجسم الحي التصوير من C. ايليجانس الأجنة. العناصر البصرية الضرورية لإنشاء ومحاذاة الورقة الضوء، بما في ذلك أشعة الليزر، وشعاع المتوسع، إيزاء وعدسات التركيز، ويمكن تركيبه بسهولة على مقاعد البدلاء البصرية. في تركيبة مع المجهر تستقيم لمسار كشف والكاميرا، وهذا يوفر حلا بسيطا لإعداد ورقة المجهر الخفيفة. هذه الهندسة يجعل البيئة عينة بسيطة. يتم وضع العينة يعيشون في كوفيت الزجاج، والذي يقام المتمركزة وانتقلت من مجموعة صغيرة من القطع الميكانيكية. كما الإضاءة رقة المجهري هو أسلوب حقل واسع مع باجتزاء القدرة، مطلوب فقط محور واحد آلية الحركة للتصوير 3D. وهذا يحد من شرط التزامن إلى عنصر واحد المسح الضوئي ويسهل تطوير البرمجيات. مقارنة iSPIM 6 دينا geomet تستقيمراي يسمح باستخدام عدسة الهدف NA عالية للكشف. مقارنة مع الاجهزة SPIM مع العدسات الهدف في المستوى الأفقي وتركيب العينة والتصوير من سلسلة من الأجنة هي أسهل. تماما، وتنفيذ هذه التقنية واضحة ومباشرة، ويمكن أن يتحقق مع القليل الخبرة في مجال البصريات. هذا هو بديل أرخص لالمجاهر مبائر مع مزايا أعلى سرعة وانخفاض الضيائية ولكن العيب قرار المحوري أقل. نحن أيضا تطوير وسيلة سهلة وقابلة للتكرار لجبل C. الأجنة ايليجانس لفي الجسم الحي التصوير باستخدام هذا النظام. الإجراء تصاعد سريع (15 دقيقة) وغير مناسبة لإجراء التجارب اليومية. لC. ايليجانس التصوير، ومزايا هذا الإعداد بسيطة ما لا يقل عن اثنين من طيات: (ط) في التصوير توتو هو ممكن من دون دوران، وبالتالي إعادة الإعمار 3D واضح وصريح؛ (ب) عينة من السهل تركيب والأجنة متعددة ولا يمكن تصوير بالتسلسلعلى نفس الشريحة. أظهرنا أمثلة من الأفلام الوقت الفاصل بين لقرار الزمنية كافية لمراقبة انقسامات الخلية ويتغير شكل الخلية. قوة المجهر ضوء ورقة لدراسة C. التنمية ايليجانس كما تم توضيح مؤخرا من قبل الآخرين 6، 7، 8، ولذلك فإن هذا الأسلوب أن تكون مفيدة جدا لدراسة التشكل والزخرفة من C. ايليجانس الجنين. يمكن لهذا النظام أيضا أن تستخدم لتحليل تطور الكائنات نموذج آخر؟ من المهم أن ندرك أن تنفيذ ورقة إضاءة المجهر لكائن صغير وشفافة مثل C. ايليجانس أقل صرامة من لكائنات أكبر مثل أجنة ذبابة الفاكهة. في التصوير جملة وتفصيلا من ذبابة الفاكهة يتطلب عادة التناوب ومتعددة بغية إعادة بناء 9، 10. الإثارة من الجانبين مع خط واحد العدسات الهدف الإثارة يمكن أيضا تقليل تأثيرات الظل الناجمة عن attenuatايون الضوء 11. حتى الآن، والإعداد المقدمة هنا لا تزال تتكيف مع الجانب صورة واحدة من أجنة ذبابة الفاكهة، مع انخفاض تبيض وانخفاض photoxicity. هذا الإعداد يمكن أن تكون مفيدة لصورة أجنة صغيرة وشفافة مثل المزقييات أو الزرد أيضا.

تشكيل وصياغة كائن حي ينطوي على تحركات الخلية، ويتغير شكل الخلية، وانقسام الخلايا وتمايز الخلايا. فهم تطور وتنسيق هذه العمليات تتطلب أدوات التصوير السريع مع القدرة على ثلاثة أبعاد وقرار التحت خلوية. من بين التقنيات مع هذه في الجسم الحي قدرات التصوير، ودعا ضوء ورقة واحدة أيضا إضاءة المجهر / انتقائية الإضاءة الطائرة المجهر لديه ميزة فريدة من نوعها لإنتاج تأثيرات المنخفض الضوئية وانخفاض photobleaching من 1،2. في ورقة إضاءة المجهر، مضاءة العينة من الجانب بواسطة ورقة الضوء، الذي يؤدي وباجتزاء البصرية. المسار الإضاءة ومسار الكشف هي متعامدة مع بعضها البعض، ويتم محاذاة الورقة الضوء ليتزامن مع المستوى البؤري كائن الكشف عدسة الهدف. يتم وضع العينة عند تقاطع المسارين، والثانية يمكن نقلها على طول محور الكشف للسماح 3D التصوير. يضيء فقط الطائرة من الاهتمام ويتم الكشف عن جميع النقاط من هذه الطائرة في نفس الوقت. هذا يزيد بشكل كبير من سرعة اكتساب ويقلل photobleaching من الضيائية وكذلك بالمقارنة مع المجهري متحد البؤر 3. عمليا، والإضاءة ورقة المجهر هو سهل الإعداد ومحاذاة: للتصوير ثنائي الأبعاد، لا المسح ضروري لا بالنسبة للجزء الكشف، ولا بالنسبة للجزء الإضاءة؛ كأسلوب واسعة المجال مع باجتزاء القدرة، ويمكن الحصول على تصوير ثلاثي الأبعاد من قبل حركة محور واحد من مرحلة عقد العينة. نحن هنا تقديم إقامة المجهر ضوء ورقة بسيطة وتنفيذها لفي التصوير جملة وتفصيلا من C. ايليجانس الأجنة. C. هي مناسبة بشكل جيد ايليجانس الأجنة في العيش في فيفو معهد العالم العربيجينج بسبب شفافيتها، النسب ثابتة ونمطية خلية مواقف 4،5. ويستند إعداد ورقة وضعت على ضوء المجهر تستقيم القياسية للكشف. بروتوكول المعروضة أدناه تفاصيل كيفية بناء ومحاذاة الإثارة وحدة / المسار واختبار وتميز ورقة الضوء وجبل العينة للتصوير 3D. كما يوفر أمثلة من الأفلام مرور الزمن اكتسب مع الإعداد على سلالات مختلفة معربا عن علامات الفلورسنت.

<tbody><table><tr><td>SPIM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan = "4" > الكشف</td></tr> عن <tr><td>المجهر العمودي</td><td>ZEISS</td><td>Axiophot 1</td><td></td></tr><tr><td>100x W الهدف (NA 1.1 ، WD 2.5 مم) &nbsp ؛</td><td>نيكون</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD مضاءة للخلف</td><td>ANDOR</td><td>DU-885K-CS0-#VP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td>ليزر إضاءة 488 نانومتر / 60 ميغاواط</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam سمارت</td><td></td></tr><tr><td>ليزر 405 نانومتر / 120 ميجاوات</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam سمارت</td><td></td></tr><tr><td>ليزر 561 نانومتر / 500 مللي واط</td><td>COBOLT</td><td>JIVE 500</td><td>&nbsp; للتصوير بفاصل زمني ، 50 أو 100 ميجا واط كاف</td></tr><tr><td>مرشح بالليزر رباعي الخط ZET 405/488/561/638</td><td>AHF</td><td>F57-405</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي اللون 405</td><td>AHF</td><td>F38-405</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي اللون 488</td><td>SEMROCK</td><td>Di01-R488</td><td></td></tr><tr><td>AOTF</td><td>AA</td><td>AOTFnC-400.650-TN</td><td></td></tr> عدسة <tr><td>مرآة</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 مم</td><td>THORLABS</td><td></td><td>تلسكوب 5X</td></tr><tr><td>عدسة 200 مم</td><td>تلسكوب THORLABS</td><td></td><td>5X</td></tr><tr><td>منظار</td><td>THORLABS</td><td>RS99 / M</td><td></td></tr><tr><td>عدسة أسطوانية f = 100 مم</td><td>THORLABS</td><td>ACY254-100-A</td><td></td></tr><tr><td>10X NA 0،3</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xyz المرحلة</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr> <td colspan = "4" > عينة</td></tr><tr><td>باكتو أجار</td><td>بكتون ديكنسون</td><td>214010</td><td>5٪ في محلول بولي</td></tr><tr><td>إل ليسين في الماء&nbsp;</td><td>الشعيرات الدموية Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>GC100F-10 ، 1.0 مم oD ، 0.58 مم ID ، 100 مم L</td><td>Havard Appartus</td><td>30-0019</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب الشفط (ماصة الفم)</td> <td>Dutsher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>M9 متوسط:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>KH2PO4 (3 جم / لتر)</td> <td>أي مورد</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (6 جم / لتر)</td> <td>أي مورد</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCL (5 جم / لتر)</td><td>أي مورد</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (1 ملي مولار النهائي)</td> <td>أي مورد</td><td></td><td></td></tr><tr><td>حامل كوفيت</td><td>محلي الصنع</td><td></td><td>بواسطة Brice Detailleur&nbsp;</td></tr><tr><td>حامل عينة</td><td>HOME MADE</td><td></td><td>بواسطة كلود موريتي &nbsp;</td></tr><tr><td>x المرحلة</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coverslip 50x20x1 مم</td><td>MARIENFELD</td><td></td> قطع ثم في مرحلة بيزو الكهربائية <td>10x20x1mm</td></tr><tr><td>مع مكبر للصوت / وحدة تحكم</td><td>PI</td><td>P-622. ZCD / E-625.CR</td><td></td></tr><tr><td>كوفيت 40 مم × 40 مم × 10 مم</td><td>HELLMA</td><td>704.002-OG.40 مم - 10 مم قلم</td><td></td></tr> رصاص <tr><td>زجاجي عالي</td><td>الماس VWR</td><td></td><td></td></tr><tr> < td colspan = "4" > برنامج</td></tr><tr><td>C ++ (Qt) برنامج محلي الصنع</td><td></td><td></td><td>تم تطويره بواسطة Olivier Blanc و Claire Chard & egrave ؛ s ، متاح عند الطلب. الحلول البديلة: micromanager أو labview&nbsp;</td></tr></tbody></table>

إعداد بسيط ضوء مجهر ورقة ل<em&gt; في توتو</em&gt; التصوير من<em&gt; c. ايليجانس</em&gt; التنمية

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

تقنيات التصوير الضوئية سريعة ومنخفضة هي شرط مسبق لدراسة تطوير الكائنات جملة وتفصيلا. المجهر ضوء ورقة تستند يقلل الصورة تبيض والتأثيرات الضوئية مقارنة المجهري متحد البؤر، مع توفير صور 3D مع قرار التحت خلوية. هنا نقدم الإعداد من ورقة القائمة على ضوء المجهر، التي تتألف من المجهر تستقيم ومجموعة صغيرة من عناصر البصريات الميكانيكية لتوليد ضوء ورقة. يصف البروتوكول كيفية بناء ومحاذاة المجهر وتميز ورقة الخفيفة. بالإضافة إلى ذلك، أنها تبين بالتفصيل كيفية تنفيذ أسلوب في التصوير جملة وتفصيلا من C. ايليجانس أجنة باستخدام غرفة الملاحظة البسيطة. الأسلوب يسمح للأسر 3D-ونين الأفلام الوقت الفاصل بين أكثر من ساعات قليلة من التنمية. وهذا ينبغي أن تخفف من تتبع شكل الخلية، انقسامات الخلية والبروتينات الموسومة على مدى فترات طويلة من الزمن.

ثلاث تجارب تسجيل الوقت الفاصل 3D من ثلاث C. مختلفة ايليجانس توضيح سلالات نوع البيانات التي يمكن الحصول عليها باستخدام ضوء الإعداد المجهر رقة المذكورة أعلاه. بحثنا أنه في ظل هذه الظروف الأجنة في تطوير السرعة العادية والبقاء على قيد الحياة في التصوير، بما يتفق مع تقارير سابقة تشير إلى أن التصوير SPIM يسبب مستويات منخفضة الضيائية فقط في C. ايليجانس الأجنة 6،7. سلالة الأولى يعبر عن هيستون تنصهر إلى GFP (zuIs178؛ stIs10024). تم إجراء التسجيل خلال 2 ساعة مع كومة من 20 شرائح (المسافة بين شرائح 1 ميكرون) اتخاذ كل 37 ثانية. الشكل 6 يوضح طائرة واحدة من المكدس في نقاط زمنية مختلفة. كل من نوى interphasic (السهم) ومكثف لونين الإنقسامية (رأس السهم) واضحة للعيان. سلالة الثاني يعبر عن تويولين تنصهر إلى GFP (ruIs57) وهيستونتنصهر mCherry (itIs37؛ stIs10226). تم إجراء تسجيل خلال 16 دقيقة مع كومة من 20 شرائح (المسافة بين شرائح 1 ميكرون) اتخاذ كل 105 ثانية. الشكل 7 يوضح طائرات مختلفة من المكدس ونقاط زمنية مختلفة. الفيلم يعرض 3D المرتبطة 1 اعادة البناء في الوقت 3 نقاط على التوالي. خلال الانقسام، المغزل الإنقسامية (الأخضر) والكروموسومات مكثف (الحمراء) مرئية مما يتيح تتبع توجهات انقسام الخلايا أثناء التطور بشكل واضح. سلالة الثالث يعبر عن ئي VIT-2 تنصهر إلى GFP (pwIs23) وغشاء ملزمة mCherry (ltIs44). تم إجراء تسجيل خلال 25 دقيقة مع كومة من 10 شرائح (المسافة بين شرائح 1 ميكرون) اتخاذ كل 30 ثانية. الشكل 8 يوضح طائرات مختلفة من المكدس ونقاط زمنية مختلفة. تحركات سريعة من جزيئات البروتين الدهني صفار (الخضراء) داخل الخلايا يمكن بسهولةيليه. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1: الإعداد البصرية SPIM تتألف من الإضاءة والكشف وحدات، الأمامي وجهات النظر أسفل. في وحدة الإضاءة والليزر جنبا إلى جنب بواسطة المرايا مزدوج اللون دخول AOTF، التي تسيطر على السلطة من كل الليزر بشكل مستقل. ثم، التلسكوب يزيد حجم شعاع بنسبة 4 أضعاف وبيريسكوب يجلب إلى ارتفاع المجهر. عدسة اسطوانية تشكل ورقة الضوء، الذي هو تركيز من قبل الهدف الإضاءة. تم دمج وحدة الكشف في المجهر تستقيم ويتكون أساسا من عدسة الكشف والتصفية، أنبوب العدسة وEMCCD. يتم وضع العينة في التقاطع بين الإضاءة والكشف عن المسارات. يسمح مرحلة كهرضغطية العمودي (Z) النزوح من العينة<html> لاقتناء 3D. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2: حامل كوفيت يتكون حامل من 3 صفائح الألمنيوم ومشدود على المسرح كهرضغطية. يقام كفيت الزجاج قبل الربيع (باللون الأحمر). <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3: تركيب بروتوكول C. الأجنة ايليجانس للتجارب SPIM. وهي مغلفة قطعة قطع من الزجاج مع بولي-L-يسين. يتم وضع وسادة من أجار على السطح المطلي. ثم يضاف بولي-L-يسين على لوحة أجار. أخيرا، C. يتم محاذاة ايليجانس الأجنة على بولي-L-يسين المغلفة لوحة أجار. ther.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig4highres.jpg" width="500" /> الشكل 4: حامل العينة. حامل يناسب للأبعاد الداخلية للكفيت الزجاج. اثنين من الينابيع (باللون الأحمر) عقد شريحة زجاجية (موضح في الشكل 3). ثم يتم وضع هذا حامل داخل كفيت الزجاج. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> الرقم 5:. حامل عينة في سياق المراقبة ويجمد الأجنة على شريحة زجاجية وفقا لخصت البروتوكول حتى في الشكل 3 يقام الشريحة من قبل صاحب العينة هو موضح في الشكل (4) يتم إدراج صاحب العينة في كوفيت الزجاج، عقدت من قبل صاحب موضح في الشكل 2. ورقة الضوء الأفقي وطlluminates الأجنة من الجانب. عدسة الهدف هو الكشف العمودي، فوق العينة. <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> الرقم 6: تسجيل من C. ايليجانس الجنين إبداء الانصهار هيستون :: GFP الصور طائرة واحدة من الجنين وراثيا إبداء هيستون :: الانصهار GFP (zuIs178؛ stIs10024) في نقاط زمنية مختلفة الصور المستخرجة من تسجيل الوقت الفاصل 3D:. مداخن مصنوعة من شرائح 20 ( المسافة بين شرائح 1 ميكرون)؛ زمن التعرض لكل شريحة: 30 ميللي ثانية؛ الفاصل الزمني بين أكوام: 37 ثانية؛ مجموع اكتساب الوقت: 2 ساعة. السهم: نواة interphasic، رأس السهم: مكثف لونين الإنقسامية. في ر = 0 دقيقة الجنين في مرحلة 2 خلية وعلى ر = 120 دقيقة الجنين يحتوي على حوالي 70 الخلايا كما هو متوقع في ظل ق التنموية العاديةتبول (لاحظ أن فقط الخلايا الواردة في طائرة واحدة واضحة في الصور وليس كل خلايا الجنين). كانت قوة الإضاءة 30 μW في 488 نانومتر (تقاس في الخروج من الهدف إضاءة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو.</a> <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> الرقم 7: تسجيل لC. ايليجانس الجنين تعبر عن تويولين :: الانصهار GFP وهيستون :: mCherry الانصهار. الصور المستخرجة من 3D الوقت الفاصل بين تسجيل لC. ايليجانس الجنين تعبر عن تويولين :: الانصهار GFP (ruIs57) وهيستون :: mCherry الانصهار (itIs37؛ stIs10226). ظروف التسجيل: الاستحواذ على كومة من 20 شرائح (المسافة بين شرائح 1ميكرون) كل 105 ثانية؛ مجموع اكتساب الوقت: 16 دقيقة؛ وقت التعرض: 200 ميللي ثانية لكل قناة. لوحة ويظهر 10 شرائح من نفس كومة. يظهر لوحة ب نفس شريحة كل 210 ثانية. كانت قوة الإضاءة 30 μW و 300 μW، ل488 و 561 نانومتر ليزر، على التوالي (قياس في الخروج من الهدف إضاءة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو.</a> <img alt="الرقم 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> الرقم 8: تسجيل من C. ايليجانس الجنين تعبر عن VIT-2 :: GFP الانصهار والتي تستهدف غشاء mCherry. الصور المستخرجة من 3D الوقت الفاصل بين تسجيل لC. ايليجانس الجنين تعبر عن الانصهار VIT-2 :: GFP (PWIS23) وmCherry التي تستهدف الغشاء (ltIs44). شروط تسجيل: الاستحواذ على كومة من 10 شرائح (المسافة بين شرائح 1 ميكرون) كل 30 ثانية؛ مجموع اكتساب الوقت: 25 دقيقة؛ زمن التعرض لكل قناة: 200 ميللي ثانية. لوحة ويظهر شرائح الأولى من نفس كومة 5. يظهر لوحة ب نفس شريحة كل 30sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو.</a>

يصف هذا البروتوكول الإعداد المجهر رقة الضوء وتنفيذها لفي الجسم الحي التصوير من C. ايليجانس الأجنة.

إعداد بسيط ضوء مجهر ورقة ل<em&gt; في توتو</em&gt; التصوير من<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; التنمية

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير تطور C Allergan باستخدام مجهر الورقة الضوئية الفلوري. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إعداد المجهر القائم على الورقة الضوئية، والذي يتكون من مجهر رأسي ومجموعة صغيرة من العناصر البصرية الميكانيكية لتوليد الورقة الضوئية. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تثبيت الجنين.تتمثل الخطوات الأخيرة في ضبط ورقة الضوء على الجنين وتسجيل مراحل نموه. ويمكن أن تُظهر النتائج ديناميكيات البروتينات الموسومة فلوروسنتياً خلال نمو *C. elegans* عبر تحليل مقاطع الفيديو ثلاثية الأبعاد والفيديوهات ذات الفاصل الزمني. وتتمثل المزايا الرئيسية لمجهر ورقة الضوء مقارنة بالطرق الحالية الأخرى، مثل المجهر البؤري، في أنه يسمح بتصوير أسرع مع سمية ضوئية أقل.ثالثاً، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول تطور الختم. كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل الرؤي أو أسماك الزبرا. وسيكون عرض الإجراء واضحاً.شيلز، مهندس من مختبري، وبولين ليناك، مهندسة من مختبر فان. يصف هذا القسم عملية تجميع التجهيزات، ويمكن تركها مجمعة لجميع التجارب. بمجرد وضع الليزرات والمراشحات والتلسكوب والميريسكوب على الطاولة البصرية، قم بتثبيت العدسة الأسطوانية لتوليد الشريحة الضوئية.يتم ضبط عدسة أخرى للتركيز. يجب أن تتطابق النقطة البؤرية لعدسة الإضاءة مع النقطة البؤرية للجسم لعدسة الكشف. الآن، قم بإسقاط الشعاع على الجدار أو الشاشة وحرك عدسة الإضاءة على طول محور الشعاع حتى تصبح حدود الإسقاط حادة.قم بتضمين مرشح انبعاث رباعي الخطوط وكاميرا E-M-C-C-D في إعداد المجهر. ثبت مرحلة الترجمة اليدوية الثانية إلى الأولى بشكل عمودي. ثم قم بربط المجموعة ببراغي إلى منصة المجهر الموجودة.بعد إزالة هدف إضاءة العدسة الأسطوانية المحددة، ضع التجميعة على المجهر وأعد وضع مجموعة الإضاءة على المنصات. قم بتثبيت حامل qve عند التقاطع العمودي لمسار الإضاءة ومسار الكشف. والآن، افحص الشريحة الضوئية.املأ وعاءً زجاجياً بمحلول الفلورسين وثبته في الحامل الموجود على المنصة. يجب أن تكون الشريحة الضوئية مرئية، وأن تكون أفقية وفي المركز بالنسبة لعدسة الشيئية الخاصة بالكشف.بعد ذلك، قم بإزالة العدسة الأسطوانية. قم بتحسين ورقة الضوء عن طريق الإزاحة ثلاثية الأبعاد لعدسة الإضاءة، ثم التقط صورة لقياس سمك ورقة الضوء. وتعتمد هذه القيمة على فتحة عدسة الشيئية.بعد ذلك، تأكد من استبدال العدسة الأسطوانية. أولاً، قم بقص قطعة من الزجاج بسمك 1 ملم، وبأبعاد 10 ملم في 20 ملم. استخدم قلم تحديد ماسي.بعد ذلك، أضف 20 µL من poly L lysine إلى جانب واحد، وبمجرد أن تجف، ضعها بمحاذاة شريحة ثانية. وفي وضع ثابت، أضف قطرة من agar بتركيز 5% وقم بتسويتها باستخدام وزن شريحة ثالثة توضع في الأعلى. بعد جفاف agar، قم بإزالة الشريحة الثالثة وقص وسادة agar على بعد 3 mm من حافة الشريحتين المتبقيتين فوق الشريحة التي لا تحتوي على poly L lysine.بعد ذلك، قم بإزالة الشريحة المثبتة، مع ترك جزء بارز من الآغار. قم بتغطية الآغار بـ 20 µL من poly L lysine واتركه حتى يجف. الآن، ضع ديدان GR في زجاجة ساعة مملوءة بوسط M nine تحت مجهر تشريحي.اقطع الديدان باستخدام مشرط بمستوى الفرج، مما يؤدي إلى تحرير البويضات. بعد ذلك، حدد الأجنة التي تمر بالمرحلة المراد دراستها واجمعها باستخدام ماصة شعرية دقيقة. انقل الأجنة إلى الجزء البارز من الآجار في الشريحة المجهزة، بجوار حافة الشريحة مباشرةً، وليس على حدود الآجار.بعد ذلك، قم بمحاذاة الأجنة باستخدام ماصة شعرية دقيقة أثناء إزالة السائل. ومن خلال عملية الشفط، ستلتصق الأجنة بـ polyol lysine. من المهم جداً وضع الأجنة بشكل جيد للحصول على تسجيل دقيق، وهذا يتطلب استخدام ماصة شعرية ذات فتحة مناسبة.إذا كان الحجم صغيراً جداً، فسيصعب تحرير الأجنة. أما إذا كان كبيراً جداً، فسيصعب التحكم بدقة في التدفق المتسرب ومحاذاة الأجنة. قم بتغطية الشريحة بوسط M nine في طبق بتري وتأكد من أن الأجنة لا تزال ملتصقة بالأجار باستخدام التكبير. الآن، قم بتثبيت الشريحة المجهزة والأجنة بحامل العينات الذي يتناسب مع جهاز vete.الحامل هو أداة مصنعة داخلياً ومصممة لتناسب جهاز vete. بعد ذلك، قم بتثبيت جهاز vete على منصة Pizo electric، وتحت إضاءة المجال المضيء (brightfield)، حدد موقع الجنين. والآن، قم بتشغيل الحزمة البرمجية التي تتحكم في الموالف البصري الصوتي (acoustic optic tuneable).قم بتصفية الكاميرا والمنصة. لقد كُتب هذا البرنامج داخلياً، ولكن يمكن أيضاً استخدام البرامج المجانية من Micromanager. أولاً، اختر خط الليزر.بعد ذلك، قم بضبط المنصة على طول المحور x حتى تصل ورقة الضوء إلى أقصى سطوع لها. ثم اضبط البعدين الآخرين، Y و Z، حتى تصل نسبة الإشارة إلى الضجيج إلى أفضل مستوياتها. قد يتطلب الأمر تكرار هذه العملية لكل جنين.يعد هذا المفتاح أساسياً لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء للحصول على تسجيل جيد من خلال ترجمة المرحلة الحرة، ودعم الهدف والقضاء عليه عندما تكون العلاقة مجرد وسيلة للحصول على محاكاة دقيقة للجنين وأفضل تباين. الآن، للحصول على مجموعة صور بنظام التصوير الزمني (time lapse)، قم بضبط قدرة الليزر، ووقت التعرض، والربح (gain)، والفاصل الزمني للتصوير وفقاً لمستوى الفلورة في الجنين وسرعة العملية البيولوجية التي يتم تحليلها. لزاك.تم تحديد المسافة بين المقاطع ومواقع بدايتها ونهايتها في تصوير خلايا expressing a histone GFP construct. تم إجراء تصوير بفاصل زمني لمدة ساعتين باستخدام مجموعات مكونة من 20 مقطعاً تم التقاطها كل 37 ثانية. كانت انقسامات الخلايا مرئية بوضوح في سلالة تعبر عن tubulin مدمج مع GFP و histone مدمج مع m cherry، حيث تم أخذ التسجيلات لمدة 16 دقيقة كل 105 ثوانٍ.تظهر عمليات التصيير ثلاثي الأبعاد عند ثلاث نقاط زمنية. وتظهر خيوط المغزل الانقسامي والكروموسومات المكثفة بوضوح، ويمكن تتبعها بسهولة خلال انقسامات الخلايا. وفي سلالة ثالثة، تم تصوير بروتين APO lipoprotein vit two المدمج مع GFP مع وسم غشاء الخلية بـ mCherry.على مدار 13 دقيقة، تم التقاط 10 مجموعات من المقاطع كل 27 ثانية. كان من السهل تتبع جسيمات البروتينات الدهنية سريعة الحركة. نستخدم هنا ورقة الضوء التي تم تشكيلها باستخدام طرق أكثر تعقيداً لإنتاجها.يمكن تنفيذ تقنية ورقة الضوء لتحسين الدقة المكانية بشكل أكبر.

setting-up-simple-light-sheet-microscope-for-toto-imaging-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

توضح هذه المقالة تقنية لتصور الأحداث المبكرة من التطور الجنيني في...

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

يصف هذا البروتوكول كيفية تقسيم الصورة الخلايا داخل الأنسجة في انواع معينة ايليجانس الأجنة. بينما العديد من البروتوكولات تصف كيفية انقسام الخلايا في صورة الجنين في وقت مبكر، ويصف هذا البروتوكول كيفية صورة انقسام الخلايا داخل الأنسجة النامية خلال منتصف أواخر مرحلة التطور الجنيني.

تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

شفافية يمكن الأمعاء C. ايليجانس بمثابة "في فيفو أنسجة دائرة" لدراسة أبيكوباسال الغشاء والتجويف نشوء حيوي على مستوى خلية واحدة وسوبسيلولار أثناء توبولوجينيسيس متعددة الخلايا. هذا البروتوكول يصف كيفية الجمع بين العلامات القياسية والوراثية فقدان لوظيفة [رني/] والنهج المجهري تشريح هذه العمليات على مستوى جزيئي.

الأمعاء C. ايليجانس "كنموذج" ل Morphogenesis التجويف بين الخلايا و في فيفو الاستقطاب نشوء غشاء حيوي على مستوى الخلايا المفردة: وضع العلامات تلطيخ جسم والخسارة [رني] من وظيفة تحليل وتصوير

هنا ، نقدم نهج التوافقية باستخدام المجهر عاليه الدقة ، والاداات الحسابية ، ووضع العلامات خليه واحده في الاجنه c. ايليجنس المعيشة لفهم ديناميات خليه واحده اثناء النمو العصبي.

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

يصف هذا العمل بروتوكولا شبه عالي الانتاجيه يسمح بالتصوير المتزامن ثلاثي الابعاد لتولد الاجنه في الاجنه من 80 إلى 100 درجه مئوية في التشغيل الليلي الواحد. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تضمين أدوات معالجه الصور والمرئيات لتبسيط تحليل البيانات. الجمع بين هذه الأساليب مع سلالات مراسل مخصص يتيح رصد مفصل لتولد الاجنه.

طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس

هنا ، نقدم بروتوكولا لإعداد وتركيب أجنة Caenorhabditis elegans ، وتسجيل التطور تحت مجهر 4D وتتبع سلالة الخلايا.

4D المجهري: كشف Caenorhabditis elegans التطور الجنيني باستخدام المجهر نومارسكي

وقد تم تقديم بروتوكول لتصوير microtubules الحيوية في الجسم الحي باستخدام البروتين ملزمة نهاية المسمى fluorescently. وصفنا أساليب لتسمية, صورة, وتحليل microtubules الحيوية في الخلايا العصبية الميكروتبول الجانبي الخلفي (PLM) من C. elegans.

في الجسم الحي تقييم ديناميات Microtubule والتوجه في Caenorhabditis elegans الخلايا العصبية

يمكن أن يوفر الفحص المجهري فائق الدقة نظرة تفصيلية على تنظيم المكونات داخل مجمع المشابك في الانقسام الاختزالي. هنا ، نوضح بروتوكولا لحل البروتينات الفردية لمجمع Caenorhabditis elegans synaptonemal.

الفحص المجهري فائق الدقة للمجمع المشبكي داخل الخط الجرثومي Caenorhabditis elegans

نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص Epon بعد التضمين للضوء المترابط والمجهر الإلكتروني باستخدام بروتين فلوري يسمى mScarlet. يمكن لهذه الطريقة الحفاظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد. هذه التقنية قابلة لمجموعة واسعة من التطبيقات البيولوجية.

Epon Post تضمين الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني

يصف هذا البروتوكول التصوير بفاصل زمني قائم على الموائع الدقيقة C. ايليجانس عبر تطور ما بعد الجنين بأكمله.

تصوير C. ايليجانس عالي الدقة عبر جميع مراحل اليرقات

تعلم إعداد مجهر الورقة الضوئية لتصوير أجنة C. elegans في توتو. تتيح هذه الطريقة تصويرًا أسرع مع سُمّية ضوئية أقل مقارنة بالمجهر المكافئ، مما يساعد الباحثين على دراسة ديناميكيات البروتينات المُصَوَّرة.

إعداد بسيط ضوء مجهر ورقة ل

استكشف المزيد من الفيديوهات