في الطريقة المختبر لمراقبة التفاعلات بوساطة selectin E-البروستاتا بين الخلايا السرطانية المنتشرة المستمدة من المرضى والبطانية الإنسان خلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص التفاعلات بين خلايا سرطان البروستاتا النادرة و e selectin التي تعبر عن الخلايا البطانية باستخدام مجموعة تدفق الشريحة الدقيقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء شريحة صغيرة أولا ب fibronectin. الخطوة الثانية هي زراعة الخلايا البطانية للوريد السري البشري أو VE في نظام تدفق ديناميكي على شريحة صغيرة بعرض قناة صغيرة.

بعد ذلك ، يتم تصنيف خلايا سرطان البروستاتا بمستضد غشائي خاص بالبروستاتا أو جسم مضاد أحادي النسيلة متوافق مع البشر PSMA ، والذي يتم استيعابه. الخطوة الأخيرة هي زرع خلايا سرطان البروستاتا المضادة ل PSMA على e selectin التي تعبر عن ve. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري بالفيديو لإظهار التفاعلات بين خلايا سرطان البروستاتا والخلايا البطانية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل غرفة تدفق اللوحة المتوازية والتجميعات الديناميكية الأخرى ، هي أنه باستخدام هذه التقنية يمكنك فحص التفاعلات بين خلايا سرطان البروستاتا النادرة ، مثل الخلايا السرطانية المنتشرة والخلايا البطانية المزروعة في نظام تدفق ديناميكي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ورم خبيث ، مثل كيف تنتشر خلايا ورم البروستاتا عبر نظام الأوعية الدموية؟ هل يستخدمون نفس الآلية التي تستخدمها الكريات البيض أثناء تنظيفها؟

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية لأنها تنطوي على زراعة طبقة أحادية من الخلايا البطانية في قناة ضيقة تحت التروية تحت غطاء مزرعة الأنسجة. أولا ، اشطف الشريحة الصغيرة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS. ثم قم بتغطية الشريحة الصغيرة برفق ب 200 ميكرولتر من 50 ميكروغرام لكل مليلتر من الفبرونيكتين باستخدام حقنة قفل إغراء مليلتر واحد.

قم بتغطية الشريحة الدقيقة بالغطاء واحتفظ بها داخل غطاء مزرعة الأنسجة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم ببث 200 ميكرولتر من وسط نمو qve الدافئ فوق الشريحة الصغيرة واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يمنع التوزيع البطيء للسائل في الشريحة الصغيرة تكوين الفقاعات في القناة.

أثناء التروية ، قم بإعداد تعليق vex عن طريق شطف vex باستخدام PBS وإضافة 0.1٪ كولاجيناز بالإضافة إلى 0.05٪ EDTA في PBS لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. جهاز الطرد المركزي في ملليلتر من متوسط النمو عند 180 مرة ز لمدة خمس دقائق. ثم قم بقياس تركيز الخلية باستخدام مقياس الخلوي الدموي وقم بإعداد 10 ملايين خلية لكل 100 ميكرولتر من وسط النمو.

بعد ذلك ، قم بإزالة الوسيط بعناية من مدخل الشريحة الصغيرة. باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، اجعل الشريحة الصغيرة إلى مستوى العين وباستخدام حقنة قفل إغراء سعة مليلتر واحد ، قم بعمل 200 ميكرولتر من تركيز vex المحضر في القناة. مطلوب توخي الحذر في هذه الخطوة لمنع تكوين الفقاعات إذا ظهرت الفقاعات ، واستمر في الانتشار لفترة أطول قليلا حتى تدخل الفقاعات إلى قناة المخرج.

بعد ذلك ، قم بإدخال حجم متساو يبلغ حوالي 80 ميكرولترا من وسط VE في كل من مدخل ومخرج الشريحة الصغيرة. هذا يمنع تدفق الخلايا في أي من الاتجاهين. قم بتغطية الشريحة واحتفظ بها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.

لبدء تجميع غرفة التدفق ، ضع حقنة معقمة سعة 20 مليلتر ، وموصلات إغراء للإناث والذكور ، ومضخة حقنة وأنبوب في الحاضنة لمدة 15 دقيقة لتقليل الحجم الميت. أنابيب مستعملة بقطر داخلي 0.04 بوصة. يمنع قطر الأنبوب الأصغر تكوين الفقاعة.

بعد ذلك ، املأ المحقنة سعة 20 مليلتر ب 12 مل من وسط VE الدافئ. قم بإزالة الفقاعة من المحقنة تماما. املأ مدخل الشريحة الصغيرة بوسط VE.

قم بتوصيل هذا التجميع بالشريحة الصغيرة. قم بتوصيل موصل المخرج برفق بالشريحة الصغيرة. أحضر الإعداد إلى الحاضنة وقم بتوصيله بمضخة الحقنة.

ثم اضبط المضخة على معدل قص 10 ميكرولتر في الدقيقة قبل ترك الخلايا طوال الليل في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بتفكيك الإعداد عن طريق إزالة الموصل المتصل بمدخل الشريحة الصغيرة. ثم قم بإزالة موصل المخرج الثاني لتنظيم التعبير عن الاختيار على الخلايا البطانية.

تحضير وسط نمو طازج يحتوي على إنترلوكين واحد بيتا. استنشق الوسط في حقنة 10 ملليلتر. قم بإزالة الوسط المتبقي من مدخل الشريحة ، ثم أضف جديدا ومتوسطا يملأ المدخل بالكامل.

قم بتوصيل المحقنة بالشريحة. اضبط مضخة المحقنة بمعدل قص 10 ميكرولتر في الدقيقة لمدة أربع ساعات في الحاضنة أثناء حضانة إنترلوكين بيتا واحدة من vex ، وقم بإعداد خلايا سرطان البروستاتا المضادة ل PSMA Alexa 4 88. أولا ، أضف 0.05٪ تريبسين EDTA إلى خلايا سرطان البروستاتا MDA لمدة دقيقة واحدة.

لا تعرض الخلايا للتربسين لفترات أطول لأنها يمكن أن تؤثر على الببتيدات السكرية الموجودة على سطح الخلية. الطرد المركزي للخلايا عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق حنك خلية MDA في ملليلتر واحد من Hank's Buffer وأضف حضانة الجسم المضاد ل PSMA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في مكان مظلم ، مع تعليق الخلايا أثناء الحضانة.

بعد 30 دقيقة ، قم بالطرد المركزي لمحلول الخلية عند 800 مرة G لمدة خمس دقائق. استنشق الحبيبات وأعد تعليقها في مليلتر واحد من مخزن هانك. عد خلايا MDA المسماة ورفع التركيز النهائي إلى 1 مليون خلية لكل مليلتر.

املأ حقنة سعة خمسة ملليلتر بخلايا MDA المسمى وقم بإزالة الفقاعات. قم بتشغيل المجهر المقلوب واضبط إضاءة أداة تجعيد الشعر على 10 × هدف. أحضر مضخة الحقنة على نفس مستوى مرحلة العينة من المجهر واضبطها على عشرة سنتات واحدة لكل سنتيمتر مربع من إجهاد القص.

بعد ذلك ، افتح برنامج رؤية Zeiss Axio. حدد الهدف على شاشة الكمبيوتر. قم بإنشاء مجلد جديد ضمن خيار الأدوات في البرنامج.

افتح خيار التجارب الذكية في Axio vision واضبط الإعدادات لتسجيل مقاطع فيديو قصيرة 32 لمدة 30 دقيقة لفيديو الفلورسنت المباشر ، اضبط خيارات الصورة. تساعد هذه المعلمات في الحصول على مقاطع فيديو قريبة من معدل إطارات الفيديو باستخدام كاميرا Zeiss MRM لتصور العرض الكامل لقناة التدفق عند هدف 10 × على شاشة الكمبيوتر ، واستخدام مفتاح محول حامل CM على المصباح الزئبقي قبل وضع المحقنة والموصل الذي يحتوي على الخلايا على مضخة المحقنة. بعد ذلك ، قم بتوصيل الموصل بقناة المدخل المملوءة للشريحة الصغيرة التي تحتوي على فأس محفز بيتا واحد إنترلوكين.

قم بتوصيل قناة المخرج بالموصل المتصل بالأنبوب. ضع الأنبوب في طبق أو أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر لتجميع التدفق من خلاله. ابدأ التسريب من خلال الشريحة الصغيرة بمعدل 10 ميكرولتر في الدقيقة.

راقب التفاعلات بين الخلايا البطانية وخلايا MDA المصنفة أو CTCs المصنفة المشتقة من المرضى الذين يقل حجمهم عن 488 نانومتر. تصفية على مجهر التألق epi. ابدأ في تسجيل التجربة كمقاطع فيديو قصيرة 32.

أثناء تحليل التشغيل ، قم بقياس سرعة التدحرج. تقاس سرعة التدحرج بقسمة المسافة التي تقطعها الخلايا بمرور الوقت. يظهر هنا ثقافة بين عشية وضحاها لطبقة أحادية من الخلايا البطانية.

على الشريحة الصغيرة. تظهر المقاييس أن 100٪ من الشريحة الصغيرة مرئية باستخدام هدف خمسة x بينما 70٪ مرئية باستخدام هدف 10 x للتفاعلات الوسيطة المحددة ، ولا يتم النظر في الخلايا المتدحرجة عند الحواف ، مما يجعل أكثر من 70٪ من الشريحة الصغيرة متاحة لتسجيل الفيديو وتحليل التشغيل. توضح مخطط الصندوق توزيع السرعات المتدحرجة لكل من خلايا MDA غير المسماة والمضادة ل PSMA ، على الخلايا البطانية المحفزة للإنترلوكين في ظروف إجهاد القص المختلفة.

لم يلاحظ أي فرق كبير في سرعات التدحرج عند واحد وخمسة سنتيمترات مربعة عند ضغط هائل أعلى يبلغ 10 سنتات لكل سنتيمتر مربع. لوحظ وجود فرق ذي دلالة إحصائية بين السرعات المتدحرجة لخلايا MDA غير المسماة والمضادة ل PSMA ، ويظهر مقطع فيديو مخيط بمرور الوقت تم التقاطه باستخدام الدم من مريض بسرطان البروستاتا ثلاثة أنواع من التفاعلات بين الخلايا السرطانية المسمى والليكتين الذي يعبر عن ربط الخلايا البطانية حيث ترتبط الخلايا السرطانية السرطانية وتعيد توصيلها بالالتصاق المستقر حيث لم تنفصل الخلايا السرطانية السرطانية حتى بعد 30 ثانية ولا توجد تفاعلات حيث تدخل الخلايا السرطانية غير المتفاعلة إلى مجال الرؤية. يمكن أن تكون الشرائح الدقيقة سهلة الصبغة المناعية وتصويرها بالفلورسنت الالتصاق القوي لخلايا MDA المضادة ل PSMA ، المسماة MDA.

بعد الوفرة على إنترلوكين ، يمكن رؤية الخلايا البطانية المحفزة بيتا واحدة هنا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فحص التفاعلات بين الخلايا النادرة مثل خلايا ورم البروستاتا المنتشرة و S selectin التي تعبر عن الخلايا البطانية بعد هذا الإجراء. يمكن أيضا إجراء طرق أخرى مثل التألق المناعي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل وجود s selectin. يغاندس.

يمكن أن تساعد تقنيات مثل هذه الباحثين على فهم الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها ورم خبيث.