في الطريقة المختبر لمراقبة التفاعلات بوساطة selectin E-البروستاتا بين الخلايا السرطانية المنتشرة المستمدة من المرضى والبطانية الإنسان خلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص التفاعلات بين خلايا سرطان البروستاتا النادرة والخلايا البطانية التي تعبر عن e selectin باستخدام تجميعة تدفق على شريحة مجهرية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق طلاء الشريحة المجهرية ببروتين fibronectin. والخطوة الثانية هي زراعة الخلايا البطانية لوريد الحبل السري البشري أو VE في نظام تدفق ديناميكي على شريحة مجهرية ذات عرض قناة صغير.

بعد ذلك، يتم وسم خلايا سرطان البروستاتا باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مؤنسن مضاد للمستضد الغشائي النوعي للبروستاتا أو PSMA، والذي يتم استدخاله داخل الخلايا. وتتمثل الخطوة النهائية في تروية خلايا سرطان البروستاتا الموُسومة بـ anti PSMA فوق الـ ve التي تعبر عن e selectin. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفيديوِي لإظهار التفاعلات بين خلايا سرطان البروستاتا والخلايا البطانية.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل غرفة التدفق ذات الألواح المتوازية والتجميعات الديناميكية الأخرى، في أنها تمكنك من فحص التفاعلات بين خلايا سرطان البروستاتا النادرة، مثل الخلايا الورمية المتداولة والخلايا البطانية المستزرعة في نظام تدفق ديناميكي. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الانبثاث، مثل: كيف تنتقل خلايا ورم البروستاتا عبر الجهاز الوعائي الدموي؟ وهل تستخدم الآلية نفسها التي تستخدمها الكريات البيضاء أثناء عملية الهجرة؟

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه التقنية بعض الصعوبات لأنها تتضمن استزراع طبقة واحدة من الخلايا البطانية في قناة ضيقة تحت التروية داخل غطاء استزراع الأنسجة. أولاً، يتم شطف الشريحة المجهرية بمحلول ملحي منظم بالفوسفات أو PBS. ثم تُطلى الشريحة المجهرية برفق باستخدام 200 µL من الفبرونكتين بتركيز 50 µg/mL باستخدام حقنة lure lock سعة 1 mL.

قم بتغطية الشريحة الدقيقة بالغطاء واتركها داخل غطاء زراعة الأنسجة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بتروية 200 µL من وسط نمو qve الدافئ فوق الشريحة الدقيقة وحضنها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يمنع التوزيع البطيء للسائل في الشريحة الدقيقة تكون الفقاعات داخل القناة.

أثناء عملية التروية، قم بتحضير معلق vex عن طريق شطف vex باستخدام PBS وإضافة 0.1%collagenase بالإضافة إلى 0.05%EDTA في PBS لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. قم بطرد hve مركزياً في مليليترين من وسط النمو عند 180 ×g لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بقياس تركيز الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer) وحضر 10 مليون خلية لكل 100 µL من وسط النمو.

بعد ذلك، قم بإزالة الوسط بعناية من مدخل الشريحة الدقيقة. باستخدام رأس ماصة سعة 200 microliter، ارفع الشريحة الدقيقة إلى مستوى العين، وباستخدام محقنة lure lock سعة one milliliter، قم بضخ 200 microliters من تركيز vex المُحضّر بلطف داخل القناة. يجب توخي الحذر في هذه الخطوة لمنع تكون الفقاعات؛ وفي حال ظهور الفقاعات، استمر في الضخ لفترة أطول قليلاً حتى تنتقل الفقاعات إلى قناة المخرج.

بعد ذلك، قم بنقل حجم مساوٍ يبلغ حوالي 80 µL من وسط VE إلى كل من المدخل والمخرج في الشريحة الدقيقة. يمنع هذا تدفق الخلايا في أي من الاتجاهين. غطِّ الشريحة واحفظها في حضانة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 1.5 ساعة.

لبدء تجميع غرفة التدفق، ضع حقنة معقمة سعة 20 milliliter، وموصلات لور (lure connectors) ذكرية وأنثوية، ومضخة حقن وأنابيب في الحاضنة لمدة 15 دقيقة لتقليل الحجم الميت إلى أدنى حد. استخدم أنابيب بقطر داخلي يبلغ 0.04 inches؛ حيث يمنع القطر الأصغر للأنابيب تكون الفقاعات.

بعد ذلك، املأ سرنجة سعة 20 milliliter بـ 12 milliliters من وسط VE الدافئ. قم بإزالة الفقاعة من السرنجة تماماً. املأ مدخل الشريحة الدقيقة بوسط VE.

قم بتوصيل هذه المجموعة بالشريحة المجهرية. ثبّت موصل المخرج بالشريحة المجهرية برفق. ضع التجهيزات داخل الحاضنة وقم بتوصيلها بمضخة السرنجة.

بعد ذلك، اضبط المضخة على معدل قص قدره 10 µL في الدقيقة قبل ترك الخلايا طوال الليل في الحاضنة عند 37 °C. وفي اليوم التالي، قم بتفكيك الجهاز عن طريق إزالة الموصل المتصل بمدخل الشريحة الميكروية. ثم قم بإزالة موصل المخرج لزيادة تعبير e selectin في الخلايا البطانية.

قم بتحضير وسط نمو طازج يحتوي على interleukin one beta. اسحب الوسط باستخدام حقنة سعة 10 milliliter. قم بإزالة الوسط المتبقي من مدخل الشريحة، ثم أضف وسطاً طازجاً بحيث يملأ المدخل بالكامل.

قم بتوصيل المحقنة بالشريحة. اضبط مضخة المحقنة على معدل قص قدره 10 µL في الدقيقة لمدة أربع ساعات داخل الحاضنة أثناء تحضين vex بـ interleukin one beta، وقم بتحضير خلايا سرطان البروستاتا المسمى بـ anti PSMA Alexa 4 88 antibody. أولاً، أضف 0.05% trypsin EDTA إلى خلايا سرطان البروستاتا MDA لمدة دقيقة واحدة.

تجنب تعريض الخلايا للتريبسين لفترات طويلة لأن ذلك قد يؤثر على الجليكوبروتينات الموجودة على سطح الخلية. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 200 ×g لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أعد تعليق حبيبات خلايا MDA في 1 mL من محلول هانك المنظم (Hank's Buffer) وأضف الجسم المضاد anti PSMA، ثم حضن الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي مكان مظلم، مع إعادة تعليق الخلايا أثناء فترة التحضين.

بعد مرور 30 دقيقة، قم بطرد محلول الخلايا مركزياً عند 800 ×g لمدة خمس دقائق. اسحب السائل وأعد تعليق الراسب في 1 mL من محلول هانك المنظم (Hank's buffer). قم بعدّ خلايا MDA الموصومة، واجعل التركيز النهائي 1 مليون خلية لكل 1 mL.

املأ محقنة سعة 5 mL بخلايا MDA المحددة وقم بإزالة الفقاعات. قم بتشغيل المجهر المقلوب واضبط إضاءة المجمع عند استخدام عدسة شيئية 10x. ضع مضخة المحقنة في نفس مستوى منصة العينة بالمجهر واضبطها عند إجهاد قص قدره one dime per centimeter square.

بعد ذلك، افتح برنامج Zeiss Axio vision. حدد العدسة الشيئية من شاشة الكمبيوتر. أنشئ مجلدًا جديدًا ضمن خيار الأدوات (tools) في البرنامج.

افتح خيار التجارب الذكية (smart experiments) في برنامج Axio vision واضبط الإعدادات لتسجيل مقاطع فيديو قصيرة مدتها 32 ثانية لمدة 30 دقيقة. بالنسبة للفيديو الفلوري المباشر، قم بتعيين خيارات الصورة. تساعد هذه المعلمات في الحصول على مقاطع فيديو قريبة من معدل إطارات الفيديو باستخدام كاميرا Zeiss MRM لتصور العرض الكامل لقناة التدفق باستخدام عدسة شيئية 10x على شاشة الكمبيوتر، واستخدم محول تثبيت CM. قم بتشغيل مصباح الزئبق قبل وضع المحقنة والموصل الذي يحتوي على الخلايا على مضخة المحقنة. بعد ذلك، قم بتوصيل الموصل بقناة الإدخال المملوءة للشريحة الدقيقة التي تحتوي على ax المحفزة بـ interleukin one beta.

قم بتوصيل قناة المخرج بالموصل المثبت في الأنبوب. ضع الأنبوب في طبق أو أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter لتجميع التدفق. ابدأ عملية التسريب عبر الشريحة الدقيقة بمعدل 10 microliters في الدقيقة.

راقب التفاعلات بين الخلايا البطانية وخلايا MDA الموصومة أو الخلايا الورامية المنتشرة (CTCs) الموصومة والمستمدة من المرضى تحت طول موجي 488 nanometer. قم بالتصفية باستخدام مجهر الفلورسنت الانعكاسي. ابدأ بتسجيل التجربة على شكل مقاطع فيديو قصيرة مدتها 32 ثانية.

خلال تحليل إعادة التشغيل، قم بقياس سرعة التدحرج. تُقاس سرعة التدحرج بقسمة المسافة التي قطعتها الخلايا على الزمن. يظهر هنا مستنبت ليلي لطبقة أحادية من الخلايا البطانية.

على الشريحة المجهرية. توضح المقاييس أن 100% من الشريحة المجهرية تكون مرئية عند استخدام عدسة شيئية بقوة 5x، بينما تكون 70% مرئية عند استخدام عدسة شيئية بقوة 10x. وبالنسبة للتفاعلات الوسيطة المختارة، لا تؤخذ الخلايا المتدحرجة عند الحواف في الاعتبار، مما يجعل أكثر من 70% من الشريحة المجهرية متاحة لتسجيل الفيديو وتحليل إعادة التشغيل. يوضح المخطط الصندوقي توزيع سرعات تدحرج خلايا MDA غير الموصومة وتلك الموصومة بـ anti PSMA على الخلايا البطانية المحفزة بـ interleukin one beta تحت ظروف مختلفة من إجهاد القص.

لم يُلاحظ وجود فرق معنوي في سرعات التدحرج عند 1 و5 داين/سم² عند إجهاد قص أعلى يبلغ 10 داين/سم². وقد لُوحظ فرق ذو دلالة إحصائية بين سرعات التدحرج لخلايا MDA غير الموصومة وتلك الموصومة بـ anti PSMA. ويظهر مقطع فيديو مدمج زمنياً، تم تصويره باستخدام دم من مريض سرطان بروستاتا، ثلاثة أنواع من التفاعلات بين خلايا CTCs في البروستاتا الموصومة والخلايا البطانية المعبرة عن الليكتين: التثبيت (tethering) حيث تلتصق خلايا CTCs ثم تنفصل وتلتصق مجدداً، والالتصاق المستقر (stable adhesion) حيث لم تنفصل خلايا CTCs حتى بعد مرور 30 ثانية، وعدم وجود تفاعلات عندما تدخل خلايا CTCs غير المتفاعلة في مجال الرؤية. ويمكن صبغ الشرائح المجهرية مناعياً وتصويرها فلوريسنتياً بسهولة لإثبات الالتصاق القوي لخلايا MDA الموصومة بـ anti PSMA.

يمكن هنا رؤية الخلايا البطانية المحفزة بواسطة interleukin one beta بعد عملية التدفق. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فحص التفاعلات بين الخلايا النادرة مثل خلايا أورام البروستاتا الدوارة والخلايا البطانية التي تعبر عن S selectin باتباع هذا الإجراء. يمكن أيضاً إجراء طرق أخرى مثل التألق المناعي للإجابة على أسئلة إضافية مثل وجود s selectin Ligands.

يمكن لتقنيات كهذه أن تساعد الباحثين على فهم الخطوات المختلفة التي تتضمنها عملية النقيلة السرطانية.