وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في نبات الأرابيدوبسيس

نحن نقدم هنا بروتوكول فعالة وموثوق بها لالمناعية، مضان التهجين في الموقع، وتلطيخ DNA تليها الكمية، التصوير ذات الدقة العالية في نبات الأرابيدوبسيس البويضات thaliana كله جبل. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح لتحليل التعديلات لونين والهندسة المعمارية النووية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد نبات الأرابيدوبسيس Vues للتهجين الكامل والتلوين المناعي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تثبيت براعم الزهور الطازجة أولا في محلول التثبيت. الخطوة الثانية هي تشريح وتضمين الفوهات بعناية في وسادات الأكريلاميد المصغرة مباشرة على شرائح الفحص المجهري.

تتيح معالجة الأنسجة التالية تنقية الأنسجة وتغلغلها. تتمثل الخطوة الأخيرة في احتضان العينات المعالجة بمحلول أجسام مضادة للتلوين المناعي أو مسبار مصنف للفلورسنت في تهجين C two. في النهاية ، يسمح التصوير متحد البؤر عالي الدقة متبوعا بإعادة البناء ثلاثي الأبعاد بالتحليل الكمي في الحامل الكامل على مستوى الخلية الواحدة.

تم استخدام هذه الطريقة في البداية لتوفير نظرة ثاقبة لتنظيم التصوير المقطعي المحوسب في العرض ، ولكن يمكن أيضا تطبيقها لتحليل مقصورات الخلايا الأخرى في الأنسجة الأخرى من الغطس وفي الكائنات الحية النموذجية الأخرى في أنابيب الصخور الدقيقة المملوءة بمخزن BBO الطازج المبرد على الجليد عند 20 إلى 30 رسغة لكل أنبوب ، اضبط الأنابيب على التأرجح برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة نصف ساعة. بعد ذلك ، قم بتدوير الأنابيب لمدة دقيقة واحدة عند 400 Gs.ثم قم بشفط المواد الطافية بعناية ، وتخلص منها ، وأضف ملليلتر من PBT إلى الرسغ. ضع الأنابيب على الجليد لتركيب كل أنبوب من الرسغ.

استعدت على الجليد. خمسة أنابيب تحتوي على 200 ميكرولتر. مزيج أكريلاميد طازج 5٪.

خمس شرائح نظيفة من الصقيع الفائق تحمل علامة قلم رصاص ، وفكر Eloqua بنسبة 20٪ PS وفكر Eloqua بنسبة 20٪ NAPS من أنبوب واحد من الرسغ. خذ أربعة أو خمسة بطرف مقطوع وضع كل منهما في شريحة واحدة. قم بإزالة السائل الزائد عن طريق سحب العينات بعناية باستخدام إبر دقيقة.

قم بعمل جروح طولية في الرسغ وإزالة جدران الرسغ لتحرير صفوف الشفر. هذه الخطوة ستتطلب الممارسة. امنع النقد من الجفاف عن طريق إضافة ما يصل إلى 10 ميكرولتر من PBS ، ثم إلى أنبوب فوج صغير يحتوي على مزيج الأكريلاميد.

أضف بسرعة 12 ميكرولترا من NAPS و 12 ميكرولترا من PS. امزج المحلول جيدا مع سحب العينات وأضف بسرعة 30 ميكرولترا من مادة الأكريلاميد المنشطة. تخلط على شريحة مع تشريح الفتحات. ضع برفق زلة غطاء صغيرة على المستحضر واترك المحلول يتبلمر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة تقريبا.

قم بإعداد كل شريحة بهذه الطريقة لاحقا. استخدم شفرة حلاقة لتقطيع زلات الغطاء. يمكن تخزين العينات طوال الليل عند أربع درجات مئوية في وعاء مشترك مع PBS أو المضي قدما مباشرة في المعالجة.

بشكل عام ، يجب أن تتم المعالجة في برطمانات coplan مع 80 مل من المحلول. وتحت غطاء الدخان. ابدأ بتوضيح الأنسجة من خلال الحضانة في سلسلة محلول من الإيثانول الميثانول ، ومحلول الإيثانول الزيلين واحد لواحد ، ومرة أخرى في الإيثانول ثم الميثانول.

كل حمام خمس أو 30 دقيقة. انظر بروتوكول النص. بعد ذلك ، استخدم محلول PBT الميثانول الفردي مع 2.5٪ فورمالديهايد لمدة 15 دقيقة.

ثم اشطف المنديل في PBT مرتين لمدة 10 دقائق لكل حمام. بعد ذلك ، يمكن تخزين الشرائح طوال الليل عند أربع درجات مئوية إذا لزم الأمر. بعد ذلك ، خذ ما يصل إلى ست شرائح من البرطمان واستنزف السائل الزائد.

ضعها على مناديل ورقية وأضف بسرعة 100 ميكرولتر من إنزيم هضم جدار الخلية المبرد. تخلط على الفوط. ثم قم بتغطية الشرائح بزلات غطاء كبيرة.

احتضن الشرائح لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة. من المهم تحسين درجة حرارة هضم ثاني أكسيد الكربون لكل محلول إنزيمي جديد لأن هذه الخطوة ضرورية لتلوين متجانس لاحقا. اغسل الشرائح مرتين باستخدام PBT لمدة خمس دقائق لكل غسلة.

ثم قم بتصريف الشرائح الآن إلى كل شريحة. أضف 100 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي A في PBS مكتملة ب 1٪ من المراهقين واحتضان الشرائح لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة بعد الحضانة ، واغسل الشرائح مرتين باستخدام PBT كما كان من قبل ، ثم قم بإصلاح الأنسجة مرة أخرى عن طريق احتضان الشرائح في حمام PBTF الطازج لمدة 20 دقيقة. اشطف PBTF بغسلة واحدة في PBT لمدة 10 دقائق.

ثم انتقل إلى تغلغل الأنسجة عن طريق احتضان الشرائح في PBS مع 2٪ tween لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. استخدم غسلتين في PBT كل منهما خمس دقائق لإزالة المحلول النفاذ. ثم تابع تلطيخ المناعة.

ابدأ باحتضان الشرائح في الجسم المضاد الأساسي محل الاهتمام. ضع 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف في PBS مع 0.2٪ بين كل شريحة. انقل الشرائح إلى غرفة رطبة واحتضانها عند أربع درجات مئوية لمدة 12 إلى 24 ساعة.

اغسل الشرائح في حمام PBT لمدة ساعتين إلى أربع ساعات مع هزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف من واحد إلى 200 في PBS مع 0.2٪ بين 20 واحتضان الشرائح لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية. يكفي الاستحمام لمدة ساعة واحدة في PBT مع هزاز لطيف لغسل شرائح الجسم المضاد الثانوي غير المرتبط.

ثم قم بمضاد الحمض النووي بمحلول 10 ميكروغرام لكل مليلتر من يوديد البروبيديوم في PBS. اترك التلوين يستمر لمدة 15 دقيقة ثم اغسل الشرائح باستخدام PBT باستخدام هزاز لطيف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الآن قم بتركيب الشرائح بوسيط مضاد للبهتان مكمل ب 10 ميكروغرام لكل مليلتر من يوديد البروبيديوم.

بعد السماح لضبط الصورة لمدة ساعة على المجهر متحد البؤر باستخدام عدسة غمر 63 × الجلسرين. لذلك أثناء الحصول على الصور ، من الأهمية بمكان الحفاظ على إعدادات المسح متطابقة بين العينات لتمكين القياس الكمي المقارن واستخدام وضع الكشف الخطي. في وقت لاحق ، أعد بناء الصور التسلسلية إلى هياكل ثلاثية الأبعاد ، وقم بتقسيم كل نواة ذات أهمية واستخدم برنامج معالجة الصور ثلاثي الأبعاد لتحديد الإشارات.

باستخدام بروتوكول التحضير القوي على نطاق واسع ، سيحتفظ Mount Vues بالكامل بهيكلها ثلاثي الأبعاد. تصبح الهياكل تحت الخلوية مرئية بتفاصيل عالية كما هو موضح مع الكروماتين. عند تلطيخ الحمض النووي ، يظهر الكروماتين غير المتجانس كبؤر مشرقة ومحددة جيدا دون الحاجة إلى تطبيق deconvolution.

يسمح هذا البروتوكول بالتلوين المناعي المتوازي مع العديد من الأجسام المضادة في جولة واحدة. على سبيل المثال ، تم اكتشاف العلامة المساهلة المرتبطة بكروماتين U ، و H ثلاثة تريميم ليسين ميثليته أربعة ، والعلامة المرتبطة بالكروماتين غير المتجانسة H ثلاثة أحادي ميثيل ليسين 27 في تجربة واحدة على شرائح مكررة مميزة لتحليل ديناميكيات الكروماتين. تقنية أخرى متوافقة هي الفلورسنت C اثنين من التهجين أو أسماك السمك إلى 45 s.Ribosomal.

تم استخدام تكرارات الحمض النووي لتحديد مناطق التنظيم النووي. تم تصنيف المسبار مباشرة ب Alexa 4 88 ، وكان الحمض النووي ملطخا بالعدادات لتحليل التحليل ، من المهم جدا اختبار التخفيفات المختلفة وأوقات الحضانة وأوقات الحضانة لتحديد الظروف التي تعطي إشارة قوية وهوجين بأقل قدر ممكن. والندم على الجسم.

نظرا لأن هذه الطريقة تحقق الحفاظ الممتاز على الأنسجة والنفاذية المثلى لتحليل الخلية المفردة لتنظيم الكروماتين ، فإنها تمهد الطريق للعلماء في مجال بيولوجيا الخلايا النباتية أو علم التخلق النباتي للتحقيق في التنظيم النووي أو تحت الخلوي على مستوى خلية واحدة وفي سياق الإنسان بأكمله.