تقنيات إعداد متعددة الخطوات لاسترداد فئات متعددة للمجمع المستقلب في العمق والتحليل Metabolomic الإعلامية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار وسيلة فعالة لتجزئة المستقلبات في السوائل البيولوجية المعقدة من أجل الحصول على عينات مبسطة لتحسين تغطية التمثيل الغذائي. يتم تحقيق ذلك عن طريق رفع كل عينة أولا بالمعايير الداخلية لمراقبة قابلية تكرار تحضير العينة وظروف الأداة. الخطوة الثانية هي إضافة الميثانول المثلج البارد إلى كل عينة لترسيب البروتينات التي قد تتداخل مع الكروماتوغرافيا اللاحقة والتحليل بواسطة قياس الطيف الكتلي.

بعد ذلك ، تفصل خطوة استخراج السائل السائل المستقلبات المحبة للماء عن المستقلبات الكارهة للماء. الخطوة الأخيرة هي استخراج الطور الصلب لتقسيم مستقلبات الدهون إلى أحماض الفوسفوليبيدات الدهنية والدهون المحايدة. في النهاية ، يتم استخدام هذه الطريقة المدمجة متعددة الخطوات لإظهار الفصل الفعال ، وقابلية التكاثر الممتازة ، والتغطية المحسنة لأيض البلازما.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل استخراج الميثانول البسيط ، هي أننا نحصل على تغطية مستقلبة محسنة ، خاصة للدهون ، وهو أمر مهم عند إجراء دراسات توصيف التمثيل الغذائي أو عندما تكون الدهون ذات أهمية خاصة. قبل ترسيب البروتين ، قم بإعداد العينات أولا لإذابة العينات إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم برفع العينات بالمعايير الداخلية ISTD التي تم إعدادها مسبقا.

تم تعديل جميع التركيزات القياسية حسب الضرورة بناء على حساسية أجهزة MS و HPLC المستخدمة. للتحليل ، قم برفع كل عينة ب 10 ميكرولتر. كل من الحلول القياسية المحبة للماء والكارهة للماء ترفع كل عينة ب 10 ميكرولتر من محلول تحكم إيجابي واحد × اثنين أو أربعة × محلول تحكم إيجابي.

رفع جميع العينات بالمعايير الداخلية وحلول التحكم الإيجابية ، قم بدوامة كل عينة لمدة 10 ثوان. لبدء ترسيب البروتين ، أضف 400 ميكرولتر من الميثانول المثلج إلى كل عينة. دوامة لمدة 10 ثوان لكل جهاز طرد مركزي أنبوبي عند صفر درجة مئوية لمدة 15 دقيقة عند 18،000 مرة.

G, يجب أن تتشكل حبيبات البروتين في قاع الأنبوب. بعد الطرد المركزي ، انقل كل المادة الطافية إلى أنبوب ثقافة زجاجي جديد ثم تجف تحت النيتروجين. ستخضع هذه البقايا المجففة لاستخراج السائل لاحقا.

لتحليل جزء بيليه البروتين, أضف ملليلتر واحد من خنفساء الميثيل تورت الأثير أو MTBE إلى دوامة حبيبات البروتين الأبيض أو الأبيض الفاتح لمدة 30 ثانية لكل أنبوب وجهاز طرد مركزي عند صفر درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 18, 000 مرة. صب G طبقة MTBE إلى أنبوب ثقافة زجاجي جديد. نظرا لأن حجم الحبيبات سيختلف بين العينات, من المهم أن تستنشق باستمرار نفس الكمية من MTBE لجميع العينات.

على سبيل المثال ، إذا كان من الممكن صب 900 ميكرولتر فقط للعينة بأقل كمية من المادة الطافية ، فقم بصب 900 ميكرولتر. لجميع العينات, أضف ملليلتر آخر من MTBE إلى دوامة حبيبات البروتين لمدة 30 ثانية, ثم جهاز الطرد المركزي عند صفر درجة مئوية أو 15 دقيقة. أضف 18 ، 000 مرة من G كما كان من قبل ، قم بشفط طبقة MTBE وأضفها إلى أنابيب الثقافة الزجاجية المعدة مسبقا.

جفف العينات عن طريق تدفق النيتروجين وأعد تعليقها في 200 ميكرولتر من الميثانول الكلوروفورم واحد إلى واحد. انقل كل عينة إلى أنبوب الطرد المركزي وجهاز الطرد المركزي عند صفر درجة مئوية لمدة 15 دقيقة عند 18 ، 000 مرة G. بعد ذلك ، استخدم الماصات الزجاجية لنقل المادة الطافية إلى قوارير غطاء برغي لأخذ عينات السيارات. لبدء هذا الإجراء ، استخدم ماصة زجاجية لإضافة ثلاثة ملليلتر من MTBE إلى بقايا الميثانول المجففة المحضرة مسبقا والدوامة لمدة 30 ثانية.

بعد ذلك ، أضف 750 ميكرولتر من الماء إلى كل أنبوب ودوامة لمدة 10 ثوان. جهاز الطرد المركزي عند حوالي 200 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تظهر طبقتان متميزتان بعد الطرد المركزي ، قم بشفط 2.5 مل بعناية من طبقة MTBE العليا دون سحب الطبقة المائية أدناه ونقلها إلى ثقافة زجاجية نظيفة. اثنان. أضف ثلاثة ملليلتر من MTBE إلى الجزء المائي المتبقي من كل عينة.

ودوامة 10 ثوان لكل جهاز طرد مركزي أنبوبي عند حوالي 200 مرة G لمدة 10 دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، استنشق ثلاثة ملليلتر من MTBE دون الحصول على الماء وادمجه مع أنبوب MTBE السابق. سيخضع جزء MTBE هذا لاستخراج الطور الصلب لاحقا.

ركز الطبقة المائية المتبقية عن طريق التجفيف تحت النيتروجين. أعد تعليق البقايا في 100 ميكرولتر من واحد ، وأضف 400 ميكرولتر من الميثانول المثلج البارد إلى كل دوامة أنبوبية ، ثم انقلها إلى أنبوب طرد مركزي صغير. اتركيه عند سالب 80 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة للسماح لأي بروتين متبقي بالترسب في الميثانول.

الطرد المركزي التالي عند صفر درجة مئوية لمدة 15 دقيقة عند 18،000 مرة G ، يجب أن يكون هناك راسب على طول جانب الأنبوب بعد الطرد المركزي لشفط 450 ميكرولتر من المادة الطافية دون شفط الراسب ونقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف. يجف تماما في مكثف طرد مركزي مفرغ عند درجة حرارة لا تزيد عن 45 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين. أعد تعليق المادة الطافية المجففة في 200 ميكرولتر من ماء أسيتيل النتريل 5٪ والدوامة.

انقل العينات لفترة وجيزة إلى السيارات ، وأخذ العينات ، والقوارير ، وقم بالتجميد عند سالب 80 درجة مئوية. لبدء إجراء استخراج الطور الصلب ، جفف جزء MTBE الذي تم الحصول عليه سابقا تحت تدفق جيد للنيتروجين عند 35 إلى درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. عندما تجف كسور MTBE تماما ، أوقف تدفق النيتروجين وأعد تعليق كل عينة بسرعة في مليلتر واحد من الكلوروفورم باستخدام دوامة ماصة زجاجية.

اغسل وقم بتكييف استخراج الطور الصلب أو خرطوشة SPE مرتين بمقدار 400 ميكرولتر من الهكسان. تخلص من النفايات واستبدلها بأنبوب تجميع زجاجي جديد. أضف العينة إلى عمود SPE ، وقم بتطبيق الفراغ وجمع التدفق من خلاله.

باستخدام ماصة زجاجية ، أضف ملليلترا واحدا من كحول الأيزوبروبيل الكلوروفورم إلى عمود SPE واجمع التدفق في نفس الأنابيب الزجاجية. هذا هو الكسر المحايد. جفف الجزء المحايد تحت النيتروجين لمدة 10 إلى 15 دقيقة.

لتقليل الأكسدة باستخدام ماصة زجاجية ، أضف ملليلتر واحد من حمض الأسيتيك 5٪ في إيثيل الأثير إلى عمود SPE واجمع التدفق من خلاله. هذا هو جزء الأحماض الدهنية. جفف جزء الأحماض الدهنية تحت النيتروجين لمدة 10 إلى 15 دقيقة لتقليل الأكسدة باستخدام أطراف بلاستيكية.

أضف 800 ميكرولتر من الميثانول إلى خرطوشة SPE واجمع التدفق من خلال الأنابيب المخروطية البلاستيكية سعة 15 مليلتر ، هذا هو جزء الفوسفوليبيد. انقل جزء الدهون الفوسفورية إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، وجفف العينات باستخدام مكثف طرد مركزي فراغي عند 45 درجة مئوية لمدة ساعة إلى 1.5 ساعة تقريبا. أخيرا ، قم بتعليق كل عينة من الكسور الثلاثة في 200 ميكرولتر من نقل الميثانول بنسبة 100٪ إلى السيارات ، وأخذ العينات ، والقوارير ، وتخزينها في الفريزر سالب 80 درجة مئوية.

إثبات فعالية طريقة M-T-B-E-S-P-E في استخراج كل من معايير الدهون والمستقلبات الداخلية بشكل عام تم الحصول على استخلاص وتغطية أفضل للمستقلبات مقارنة بالطرق الأخرى مثل استخراج الميثانول أو استخراج MTBE فقط عند مقارنة عدد الميزات باستخدام برامج نوعية وكمية. بعد تحليل LC MS ، أظهرت مقارنة كسور M-T-B-E-S-P-E تداخلا ضئيلا بين الكسور الثلاثة التي تلي SPE ، مما يدل على الكفاءة في فصل المستقلبات الكارهة للماء إلى فئاتها الكيميائية الخاصة لتحديد المستقلب بشكل أكثر ثقة. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر استرداد المعايير الداخلية في الكسور باستخدام طريقة M-T-B-E-S-P-E ، NR 12 أن المعايير الداخلية قد تم التلميح إليها في الكسر المتعلق بفئتها الكيميائية.

لتقييم التكاثر الكروماتوغرافي للبيانات ، تم إجراء تحضير العينة على ثلاث عينات منفصلة من مراقبة الجودة في البلازما المجمعة ، وتم حقن كل عينة في ثلاث نسخ على جهاز MSS المضاعف الأصغر حجما. يوضح التداخل المتسق قابلية استنساخ إعداد الأداة والعينة. قد تكون الزيادة في الضوضاء الكيميائية التي لوحظت لوضع التأين السلبي لجزء الأحماض الدهنية ناتجة عن الملوثات في مذيبات LCM S.

لذلك ، تم تحليل المستقلبات التي ألمحت قبل تسع دقائق فقط. لا تنس أن العمل مع الكلوروفورم ، و MTBE ، والإيثيل الأثير ، وحتى الكواشف الأكثر شيوعا المستخدمة في هذه الطريقة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معطف المختبر والقفازات وحماية العين وإجراء تحضير العينة في غطاء الدخان أثناء تنفيذ هذا الإجراء.