خلية كاملة تسجيلات التصحيح، المشبك من Morphologically- وحددت Neurochemically-الحصين Interneurons

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف التأثيرات بوساطة مستقبلات GABA B في الخلايا العصبية الإيجابية بين الحصين المحددة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنتاج شرائح الحصين الحادة عالية الجودة أولا. الخطوة الثانية هي استخدام مجهر الفيديو لتحديد الخلايا العصبية بناء على تعبير YFP الوريدي والخصائص المعروفة للخلايا العصبية الإيجابية للألبومين المتوازي.

بعد ذلك ، يتم الحصول على تسجيلات مشبك تصحيح الخلية بالكامل ويتم استخدام التحفيز خارج الخلية أو التسجيلات المزدوجة لفحص التأثيرات بوساطة مستقبلات GABA B. الخطوة الأخيرة هي تصور الخلايا العصبية والتأكد من أن الخلايا العصبية المسجلة هي في الواقع إيجابية الألبومين ، وهي إما خلايا عصبية مثبطة شبه جسدية أو تغصنية. في نهاية المطاف ، تتيح هذه الطريقة توصيف التأثيرات المثبطة بوساطة مستقبلات GABA B وتسمح بتصنيف لا لبس فيه للخلايا العصبية المسجلة.

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، كيف تتواصل الخلايا العصبية البينية مع بعضها البعض ، وكيف يتم التحكم في استثارتها ، وإخراجها المشبكي بواسطة أنظمة التعديل العصبي. على الرغم من أن هذه الطريقة يوفر نظرة ثاقبة في جابايرجيك, السيطرة على الحصين في الخلايا العصبية, يمكن أيضا تطبيقها على مناطق الدماغ الأخرى, نظم العصب, أو أنواع الخلايا.

خذ الدماغ من فأر معدل وراثيا يبلغ من العمر 17 إلى 24 يوما يعبر عن YFP الوريدي الفلوري المحفوظ في سكروز الكربوجين شبه المجمد ، و CSF باستخدام مشرط ، وقم بإزالة الثلث الأمامي من القشرة ، والمخيخ ، وفصل نصفي الكرة الأرضية. قم بإزالة السطح الظهري للقشرة لتوفير سطح مستو للصق الدماغ للتقسيم. قم بلصق نصفي الكرة الأرضية على مرحلة فيوم باستخدام حمام فيوم المليء بالسكروز الأصلي الكربوجين المجمد.

قطع السائل الدماغي النخاعي 300 ميكرومتر شرائح عرضية من تكوين الحصين. انقل كل شريحة إلى غرفة احتجاز مغمورة تحتوي على سكروز الكربوجين ، A CSF عند 35 درجة مئوية. 30 دقيقة بعد وضع الشريحة الأخيرة في السكروز الدافئ ، يقوم السائل الدماغي النخاعي بنقل الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة للتخزين.

اسحب الماصات اللاصقة من الشعيرات الدموية الزجاجية بحيث يتم تحقيق مقاومة الماصة من اثنين إلى أربعة ميجا أوم. عند ملئها ، انقل شريحة الحصين إلى غرفة التسجيل ، وثبتها في مكانها بحلقة بلاتينية معلقة بألياف مفردة من الحرير. ضع الغرفة في إعداد التسجيل وابدأ التروية بتسجيل الكربوجين الدافئ A السائل النخاعي بمعدل تدفق من خمسة إلى 10 ملليلتر في الدقيقة.

استخدم كاميرا فيديو لتقييم جودة الشريحة تحت بصريات I-R-D-I-C بتكبير موضوعي 40 ×. افترض أن الشريحة ذات نوعية جيدة. إذا كان من الممكن رؤية عدد كبير من الخلايا شبه المعدنية المستديرة المتناقضة بشكل معتدل في معلمة الطبقة على أعماق 20 إلى 30 ميكرومتر تحت سطح أملس وخفيف الحفر.

باستخدام إضاءة الفلورسنت epi ، حدد الخلايا العصبية البينية سريعة الارتفاع المفترضة على أنها تلك التي تعبر عن YFP الوريدي مع جسدي كبير متعدد الأقطاب في الطبقة باراما أو بالقرب منها. قم بعد ذلك، املأ الماصات بمحلول يحتوي على تركيز كلوريد منخفض وملائم من الناحية الفسيولوجية لتحديد التيارات بعد التشابك ووضعها في حامل الماصة على مرحلة الرأس. ثم قم بتطبيق ضغط إيجابي منخفض من خلال خط الأنبوب.

اخفض الماصة إلى سطح الشريحة ، مع إزاحة قليلا إلى مركز الخلية العصبية المحددة. قم بزيادة الضغط إلى 70 إلى 80 مللي بار وخفض الماصة بسرعة عبر الشريحة إلى أعلى سوما الخلية المختارة مباشرة. اضغط على الماصة على غشاء الخلية لإنتاج غمازة عليها.

قم بتنفيذ هذه الخطوة بسرعة. من أجل منع وضع العلامات على البيوتين للخلايا المجاورة ، قم بإنشاء ختم جيجا أوم عن طريق تحرير الضغط وتطبيق أمر جهد سالب 20 مللي فولت في نفس الوقت على الماصة. بمجرد أن يبدأ الختم ، قلل أمر الجهد إلى إمكانات غشاء الراحة المتوقعة عادة بين سالب 70 وسالب 60 مللي فولت.

الآن قم بتطبيق نبضة قصيرة من الضغط السلبي لتمزيق رقعة الغشاء ، وبالتالي تحقيق تكوين الخلية بالكامل. باستخدام وضع المشبك الحالي ، حدد الخلايا العصبية بين الخلايا العصبية سريعة الارتفاع من خلال استجابتها لعائلة من فرط الاستقطاب لإزالة الاستقطاب من النبضات الحالية. لمراقبة الاستجابات المستحثة متشابكية ، ضع قطب تحفيز خارج الخلية في الشريحة عند حدود الطبقة الراديوم والطبقة الراديوم والتسجيل الجزيئي للطبقة laun oum.

في وضع مشبك الجهد ، استخدم محفز جهد ثابت معزول لتوصيل قطار مفرد أو 200 هرتز من خمسة محفزات كهربائية 50 فولت إلى المحاور قبل التشابك كل 20 ثانية. بعد ذلك ، قم بتطبيق مضادات مستقبلات الغلوتامات المؤينية على الحمام من أجل الكشف عن المونو المعزول. IPSC متشابك.

مزيد من عزل مستقبلات GABA B بوساطة IPSC مع تطبيق مضاد مستقبلات GABA. لبدء التسجيلات المقترنة. أولا ، قم بإنشاء تسجيل خلية كاملة لخلية عصبية ما قبل التشابك كما كان من قبل وتأكيد النمط الظاهري السريع الارتفاع.

بعد ذلك ، قم بتصحيح خلية CA واحدة شبه معدنية على مسافة 20 إلى 100 ميكرومتر من الخلايا العصبية البينية التي تحمل الخلايا العصبية بين المشبكية. في وضع المشبك الحالي. قم بتطبيق نبضات تيار إزالة الاستقطاب من عتبة SRA موجزة لاستنباط إمكانات العمل في الخلايا العصبية البينية.

في حالة وجود اتصال متشابك ، فإن إمكانات العمل في الخلايا العصبية الداخلية تؤدي إلى IPCs في الجهد المثبت تقريبا خلية شبه معدنية واحدة. بمجرد إنشاء الاتصال ، استنباط أزواج من إمكانات الفعل في الخلايا العصبية بين الخلايا العصبية سريعة الارتفاع قبل التشابك مع بروتوكول نبض مزدوج نموذجي لمحفزين لإزالة الاستقطاب بفاصل زمني قدره 50 مللي ثانية. بعد جمع آثار التحكم ، قم بتطبيق باكلوفين ناهض مستقبلات GABA B الانتقائي على السائل الدماغي النخاعي A ، وبالتالي تنشيط مستقبلات GABA B.

بعد ذلك ، قم بتطبيق المضاد CGP 55 8 45 لمنع التأثيرات بوساطة المستقبلات بالكامل. بمجرد اكتمال التسجيل ، اسحب الماصة ببطء من جسم الخلية في مشبك الجهد. مع زيادة المقاومة المقاسة من السلسلة ، قلل جهد الغشاء إلى سالب 40 مللي فولت لإغلاق الغشاء الجسدي عن طريق تشكيل رقعة خارجية.

بعد التسجيلات ، قم بإصلاح الشرائح عن طريق الغمر في 4٪ بارا فورمالديهايد مع 0.1 مولار فوسفات عازلة طوال الليل عند أربع درجات مئوية عازلة فوسفات الغسيل ، ثم في محلول ملحي مخزن بالفوسفات وكتلة مع مصل الماعز العادي 10٪ 0.03٪ تريتون × 100 و 0.05٪ أزيد الصوديوم لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتسمية تعبير الألبومين الاسمي ، استخدم جسما مضادا للفأر أحادي النسيلة مضادا للبارفألبومين مخففا في محلول يحتوي على 5٪ مصل ماعز عادي 0.3٪ تريتون × 100 و 0.05٪ أزيد الصوديوم في PBS يحتضن الأجسام المضادة الأولية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، اشطف الشرائح جيدا في PBS ، وقم بتطبيق الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المضادة للولايات المتحدة جنبا إلى جنب مع شريط البروتين المرتبط بالبيوتين المقترن بالفلوروكروم واحتضانه في محلول يحتوي على 3٪ مصل ماعز عادي 0.1٪ تريتون × 100 و 0.05٪ صوديوم مخفف في PBS يحتضن بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اشطف الشرائح مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام PBS متبوعا بشطفتين إلى ثلاث مرات في مخزن الفوسفات.

قم بتركيب الشرائح على شرائح زجاجية واستخدم فاصل أجار 300 ميكرومتر لمنع الشريحة من الانهيار. ثم قم بتغطية الشرائح بوسيط تثبيت الفلورسنت وختمها بورنيش الأظافر. تقييم النشاط المناعي للألبومين الاسمي للخلايا العصبية البينية ذات التكبير العالي والفتحة العددية.

تعتبر خلايا العدسة الموضوعية متفاعلة مناعية للألبومين المساوي. إذا شوهد أن الملصقات المناعية تتماشى مع الهياكل المسماة بالبيوتين ، فالتقط سلسلة من الصور ذات المحور Z باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر ، وتصوير عدن الفلورية لتحديد المورفولوجية وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد. ثم أعد بناء الصورة إلى خلية عصبية في ثلاثة أبعاد ، مع دمج الأشجار الشجيرية والمحورية.

هنا الاستجابة المشبكية المركبة للخلايا العصبية بين الخلايا العصبية سريعة الارتفاع استجابة لمحفز واحد خارج الخلية. تطبيق مضادات مستقبلات الغلوتامات المتأين ، عزلات DNQX و A PV ، التيار المثبط المشبكي الأحادي أو تطبيق IPSC لمضاد مستقبلات gabaa. ألغت غازين المكون السريع للقانون الدولي للبراءات العليا للبراءات.

كشف قطار من خمسة محفزات عن مستقبلات GABA B بطيئة بوساطة IPSC ، والتي تم حظرها عن طريق التطبيق اللاحق ل CGP. تظهر هذه الآثار إمكانات الفعل في الخلايا العصبية بين الخلايا العصبية قبل المشبكية ، سريعة الارتفاع ، والكمون القصير I PSCs في خلايا CA واحدة من الخلايا شبه المعدنية في ظل ظروف التحكم بعد الاستحمام ، وتطبيق باكلوفين والتطبيق اللاحق ل CGP. لاحظ أن باكلوفين يقلل من سعة IPSC بحوالي 50٪ بينما أدى مضاد مستقبلات GABA B إلى التعافي الكامل تقريبا لسعة IPSC.

يظهر مخطط المسار الزمني لسعة IPSC تأثير الخلايا العصبية بين الارتفاع السريع للباكلوفين و CGPA الموضحة عند تكبير 20 × كان لها سوماتا تقع على حدود الطبقة الراديوم ودمية الباراما في منطقة كاليفورنيا مع التشعبات التي تعمل عموديا وتمتد على جميع الطبقات. في حين أن غالبية المحور العصبي موجود في طبقة جسم الخلية وحولها كما هو معتاد لخلايا السلة ، تظهر صورة تكبير 60 × سلال نموذجية من المحاور تتشكل حول صلاتا شبه معدنية مفترضة ، والتي تتميز بعلامة النجمة البرتقالية. تظهر هنا إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لنفس الخلايا العصبية مع سوما والتشعبات باللون الأسود والمحور العصبي باللون الأحمر.

يتم تحديد طبقات ca one باللون الأزرق بمجرد إتقانها. يمكن إجراء هذه التقنية في يوم واحد من خلال التحليل المورفولوجي لما بعد الدكتوراه الذي يتم إجراؤه على عدة شرائح في وقت واحد بعد تطويرها. مهد هذا النهج المشترك الطريق للباحثين في الدوائر الدقيقة للحصين والقشرية لاستكشاف التنوع الفسيولوجي المورفولوجي بالإضافة إلى العلاقة المتبادلة لوظيفة البنية لأنواع الخلايا العصبية البينية.