تحديد تفاعلات البروتين يجند عن طريق المسح الضوئي التفاضلية Fluorimetry

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقدير ثابت التفكك لتفاعل ترابط البروتين. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير مخاليط من البروتين أولا بتركيزات مختلفة من الترابط مع صبغة مؤشر. الخطوة الثانية هي تسخين هذه العينات أثناء تسجيل تألق المؤشر لمراقبة تطور البروتين.

بعد ذلك ، يتم تحويل منحنيات البروتين التي تتكشف إلى سلسلة من درجات حرارة الانصهار. الخطوة الأخيرة هي ملاءمة هذه البيانات مع نموذج مناسب لتقدير ثابت التفكك. في النهاية ، يتم استخدام القياس الفلوري للمسح التفاضلي لفهم تفاعل البروتين مع روابطه بشكل أفضل.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الحرارة المتساوية ، والمعايرة ، وقياس السعرات الحرارية ، ورنين البلازما السطحية هي أنه يمكن إكمال هذه الطريقة في غضون ساعات قليلة باستخدام كميات معتدلة فقط من العينة في أداة متوفرة بالفعل في معظم المعاهد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال كيمياء البروتين ، مثل تقارب الروابط للبروتينات والقوة النسبية للتفاعلات. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن اختيار العينات لاستخدامها وتحليل البيانات قد يكون صعبا.

قبل البدء في هذا الإجراء ، قم بإعداد الحلول التالية. خليط يحتوي على الكواشف المفصلة في هذا الجدول ومخزون الترابط المورد للاهتمام بأعلى تركيز متاح ، بالإضافة إلى ستة تخفيفات عشرة أضعاف من هذا التركيز. إذا كان ثابت التفكك التقريبي معروفا من البيانات السابقة ، فقم بإعداد تركيزين على الأقل أعلى وأسفل kd.

يظهر جدول مثال هنا. اقتبس 18 ميكرولترا من الخليط في كل من الآبار الثمانية. في لوحة A-Q-P-C-R ، أضف ميكرولترين من المذيب إلى البئر الأول لكل من الآبار السبعة المتبقية ، أضف ميكرولترين من كل عضو في سلسلة تخفيف الترابط.

ضع ختم A-Q-P-C-R على اللوحة لتحقيق ختم جيد للوحة. ضع قضيب يدوي في منتصف الطبق ، وقم بتنعيم الختم على جانب واحد ، ثم كرر ذلك على النصف الآخر من اللوحة. قم بالطرد المركزي للوحة عند 500 مرة G لمدة دقيقتين لإزالة فقاعات الهواء.

بعد ذلك ، ضع اللوحة في أداة QPCR الخطوة الأولى. حدد خيار منحنى الذوبان ، مرشحات الصخور ، واختر سرعة المنحدر السريعة. قم بتشغيل التمسخ الحراري في ختام تشغيل الأداة.

انقر فوق الزر تحليل على الشاشة. احفظ ملف النتيجة. افتح برنامج التحول الحراري للبروتين.

قم بإنشاء دراسة جديدة في علامة تبويب الخصائص. قم بتسميته ، وفي علامة تبويب الشروط ، قم بتفصيل الروابط. انتقل إلى علامة التبويب ملفات التجربة واستورد ملف النتائج المحفوظ.

اضبط محتويات كل منها. حسنا ، انتقل إلى علامة تبويب التحليل واضغط على زر التحليل لتحليل النتائج. تأكد من أن البروتين في وجود المذيب وحده يعطي نتيجة مشابهة لتلك الموضحة في هذا الشكل.

بعد ذلك ، افحص درجات حرارة الانصهار التي لوحظت في النتائج في تكرار الألم. تأكد من أن هذا يظهر زيادة واضحة في درجة حرارة الانصهار مع زيادة تركيز الترابط. سيتم استخدام هذه البيانات لتوفير قيمة تقريبية لثابت التفكك كما هو موضح في الورقة المصاحبة.

هذه الحلول مطلوبة لإجراء تحديد ثابت التفكك ، مزيج رئيسي كما هو مفصل في هذا الجدول ومخزون الترابط عند 15 تركيزا مختلفا ، والتي سيتم تخفيفها عشرة أضعاف. في التجربة النهائية. من الناحية المثالية ، قم بتضمين تركيزات الترابط ، على الأقل أمرين من حيث الحجم أعلى وأقل من الدينار كويتي المقدر ، وقم بتركيز التركيزات على الدينار كويتي المقدر.

عرض مثال على سلسلة التخفيف هنا. ركز على سبع نقاط ضمن ترتيب من حيث الحجم للدينار الكويتي المقدر مع أربع نقاط أخرى على جانبي هذا. إذا كان هناك خيار ، فقم بتضمين المزيد من النقاط في القيم المشبعة.

أضف 120 ميكرولترا من المزيج الرئيسي إلى كل من الآبار الثمانية في صفيحة بئر 96 ذات قاع U لتكون بمثابة خزان للتوزيع المريح للمزيج الرئيسي. ثم استخدم ماصة ثماني القنوات لتوزيع 18 ميكرولترا من المزيج الرئيسي في عمود واحد من لوحة PCR. كرر ذلك لخمسة أعمدة أخرى لإعطاء ما مجموعه 48 بئرا مملوءا بنمط ستة في ثمانية على اللوحة.

بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من سيقان الترابط أو المذيب إلى كل من الآبار الثمانية. في لوحة أخرى من 96 بئر ذات قاع U باستخدام ماصة ثماني قنوات ، قم بشفط ميكرولترين من ثمانية مخزونات أو مذيبات مختلفة ، وأضفها إلى عمود واحد من لوحة PCR التي تم ملؤها بالمزيج الرئيسي. كرر مع نفس مخزونات الترابط أو المذيبات الثمانية.

بالنسبة لعمودين آخرين ، قم بشفط ميكرولترين من مخزون الترابط أو المذيبات الثمانية المتبقية ، وأضفها إلى العمود الرابع في اللوحة. كرر هذا لعمودين آخرين. سيعطي هذا عينات ثلاثية النسخ لجميع عينات الترابط والمذيبات البالغ عددها 16.

ضع ختم A-Q-P-C-R فوق اللوحة. الطرد المركزي للوحة عند 500 مرة G لمدة دقيقتين. ضع اللوحة في أداة QPCR وقم بتشغيل التمسخ الحراري باستخدام المعلمات المحددة مسبقا في ختام تشغيل الأداة.

انقر فوق الزر تحليل على الشاشة. احفظ ملف النتيجة. افتح برنامج التحول الحراري للبروتين.

قم بإنشاء دراسة جديدة في علامة تبويب الخصائص. قم بإعطاء هذا اسما وفي علامة تبويب الشروط، قم بتفصيل الروابط. انتقل إلى علامة تبويب ملفات التجربة، واستورد ملف النتائج المحفوظة وقم بتعيين محتويات كل منها.

حسنا ، انتقل إلى علامة تبويب التحليل واضغط على زر التحليل. اختر علامة التبويب التكرارات من القائمة الموجودة على الجانب الأيسر من الشاشة لإظهار النتائج. كثلاث نسخ.

قم بتقييم موثوقية البيانات بناء على مدى ضيق النسخ الثلاثية. يجب أن تظهر النسخ الثلاثية قابلية استنساخ ضعيفة. افحص البيانات الأولية عن كثب.

قم بتحليل البيانات باستخدام كل من طرق بولتمان أو المشتقة. لتقييم درجة حرارة الانصهار ، حدد علامة التبويب تكرار النتائج وفي مخطط النتائج المتماثل ، قم بتبديل المخطط بالزر بين tm و boltzmann و TM مشتق. حدد الطريقة التي تعطي قابلية أكبر للتكرار للعينة.

بالنسبة للعينات التي تظهر انتقالات متعددة ، من الأفضل دائما استخدام طريقة المشتقة في وضع الذوبان المتعدد. قم بتصدير النتائج لمزيد من التحقيق باستخدام Excel باستخدام علامة التبويب تصدير. ابدأ هذا التحليل بإنشاء جدول في Excel لتركيزات الترابط ودرجة حرارة الانصهار.

افتح برنامج منشور GraphPad وقم بإنشاء جدول XY. أدخل البيانات باستخدام العمود X لتركيزات الترابط والعمود Y لنتائج درجة حرارة الانصهار. في علامة التبويب التحليل، حدد خيار ملاءمة منحنى الانحدار غير الخطي.

لإدخال النموذج الصحيح، حدد جديد وأنشئ معادلة جديدة. أدخل المعادلة المناسبة كربط ربط موقع واحد. حدد مربع قواعد القيم الأولية وأدخل قواعد للقيم الأولية.

قم بتقييد المعلمة P على أنها ثابتة مساوية لإدخال التركيز النهائي للبروتين. حدد التحليل لإجراء التحليل ، والتحليل الإضافي لملاءمة البيانات مع نموذج تعاوني أو لملاءمة البيانات مع المنحنيات. يتم وصف إظهار التحولات الثنائية في درجة حرارة الانصهار في نص البروتوكول المصاحب.

تم استخدام هذه الطريقة لقياس تفاعل الهيكسوكيناز مع الجلوكوز. تشير الشاشة الأولية إلى احتمال أن يكون دينار كويتي من 0.2 إلى 1.7 مللي مولار. تظهر نتائج الشاشة الأكبر ملاءمة جيدة للنموذج لحدث ربط واحد ب KD 1.2 زائد أو ناقص 0.1 مللي مولار ، يظهر HETO SQUA L transferase WCBM المفترض تحولا حراريا قويا عند الارتباط ب GTP.

اقترحت الفحص الأولي دينار كويتي من 200 إلى 500 ميكرومولار. تشير تجربة مفصلة إلى أن ديكورات كويتية ظاهرة تبلغ 120 زائد أو ناقص 20 ميكرومولار. ومع ذلك ، عند استخدام مقياس لوغاريتمي للمحور X ، هناك تناقض كبير بين النموذج وتحليل البيانات لنفس البيانات مع نموذج تعاوني يظهر ملاءمة ممتازة للبيانات ، مما يعني أن WCBM مناهض للتعاون في ارتباطه ب GTPA لوحظت نتيجة غير عادية إلى حد ما مع الناتج المحلي الإجمالي المفترض 60 ، أوكسي بيتا د مانو ، هير اثنين أوه ، إيس WCBI.

بدون الترابط ، وبتركيزات الترابط العالية ، لوحظ نمط ذوبان أحادي الطور بسيط. ومع ذلك ، عند تركيزات الترابط المتوسطة ، لوحظت قمتان متميزتان للذوبان. يعتمد الانتقال بين مجموعتي القمم على الجرعة عبر النطاق الكامل لنمذجة تركيزات الذوبان ثنائي الطور.

كمجموع من نسبة الترابط ، فإن نتائج الترابط الحرة والعالية تعطي ملاءمة جيدة للبيانات. يتم تحسين هذا الملاءمة من خلال استقراء النتيجة التي لوحظت لتركيز الترابط العالي إلى الإشغال الكامل. تظهر البيانات التي تم الحصول عليها لنسبة WCBI المرتبطة بالترابط ملاءمة ممتازة لنموذج ربط بسيط.

مع 58 دينار كويتي زائد أو ناقص اثنين ميكرومولار بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أربع أو خمس ساعات ، بما في ذلك التكرارات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل مضان الوريد العلوي وقياس السعرات الحرارية للمعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الاعتماد على درجة الحرارة وهندسة STA. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد تقدير ثابت التفكك للتفاعل باستخدام إنفلونزا المسح التفاضلي.