أجهزة ميكروستروكتوريد Microinjection الأمثل وتصوير يرقات الزرد

الهدف العام من هذه المنهجية هو جعل الحقن المجهري ليرقات الزربرا أسهل وأكثر دقة. تساعد هذه الطريقة الباحثين الذين يستخدمون أنظمة نماذج الزرد على شل حركة يرقات الزرد في اتجاهات محددة في المصفوفات الكبيرة. تسمح هذه التقنية بالوصول بسهولة إلى أنسجة معينة للحقن المجهري والتصوير ، وهي فعالة للغاية عندما تكون هناك حاجة إلى أعداد كبيرة من اليرقات لتطبيقات مثل العدوى أو نماذج سرطان الطعم الغريب.

استراتيجيات التصنيع الخاصة بي في نماذج أسماك الزرد مكملة للغاية. واحد من صنع الإنسان وبسيط. والآخر حي ومعقد.

كلاهما يشترك في نفس مقياس الحجم. كلاهما شفاف. وكلاهما يتيح الملاحظات بدقة خلية واحدة.

كما تظهر هنا ، يمكن دمجها بسهولة ، ويمكن أن يكون لها تطبيقات لدراسة أي مرض رئيسي تقريبا. بعد تحضير كتلة PDMS في طبق بتري مغطى بغشاء رقيق من E-3 ، وفقا لبروتوكول النص ، استخدم ماصة نقل لنقل العدد المطلوب من الأجنة على سطح كتلة PDMS. باستخدام حلقة شعر أو أداة مماثلة ، ادفع الأجنة إلى أقسام البنية المجهرية ، خاصة للاتجاهات الظهرية والبطنية.

عند تحميل اليرقات في الفتحات ، من المهم أن يكون لديك كمية كافية من الماء الذي يغطي كتلة PDMS للسماح بسهولة التلاعب. من المهم أيضا دفعها إلى الفتحات بحيث تظل في مكانها أثناء الحقن. لتوجيه سمكة الزرد على قنوات البنية المجهرية المعدة مسبقا وفقا لبروتوكول النص ، استخدم ماصة نقل لسحب E-3 من كتلة PDMS المنقوشة.

يجب أن ينخفض مستوى E-3 إلى ما دون حافة الكتلة ، ولكن لا يزال موجودا في الخزان والقنوات ، وتبقى طبقة رقيقة على PDMS. باستخدام ماصة نقل ، انقل 10 أجنة مخدرة إلى الخزان ، مع الحرص على عدم فيضان الحواف. باستخدام حلقة الشعر ، قم بمعالجة كل جنين في رأس القمع ، أولا عند مدخل القناة المناسبة ، مع التأكد من أن الجنين لديه الاتجاه المناسب عند دخوله القناة.

بعد ذلك ، استخدم حلقة شعر لتحريك كل جنين أسفل القناة ، حتى يصل إلى الميزات الدقيقة الموجهة في جدران القناة التي تبقيه في مكانه. بعد تحضير إبر الحقن المجهري ومحلول الحقن المجهري ، استخدم طرف ماصة مدبب بدقة لتحميل خمسة ميكرولترات من المحلول في الإبرة. قم بتركيب الإبرة في مناور دقيق مثبت على حامل مغناطيسي ، وقم بتوصيله بحاقن دقيق لمضخة PICO.

بعد ذلك ، استخدم الملقط لكسر طرف الإبرة بزاوية 45 درجة عن طريق الضغط على الطرف المدبب. اضبط حجم بلعة الحقن على نانولتر واحد عن طريق ضبط وقت الحقن على وحدة التحكم في مضخة PICO. اضبط زاوية إبرة الحقن المجهري على وحدة التحكم في المعالجة الدقيقة ، بدءا من 45 درجة مع الإبرة الموازية لطول الجنين.

يمكن استخدام زاوية أكثر انحدارا لتقليل الحركة الجانبية للجنين أثناء الحقن المجهري. التحكم في طبق بتري باليد اليسرى ، والحاجة إلى معالج دقيق مع اليمين ، قم بتقريب الإبرة قدر الإمكان من الموقع المقصود للحقن المجهري ، مثل الحويصلة الأذنية. باستخدام وحدة التحكم في المعالجة الدقيقة ، أدخل الإبرة في الأنسجة المستهدفة ، واستخدم مفتاح قدم مضخة PICO لحقن الحجم المحدد مسبقا.

إذا كان النسيج يقاوم الاختراق ، فاضغط برفق على مقبض وحدة التحكم في المعالجة الدقيقة. لتحرير الأجنة ، استخدم ماصة نقل لتدفق E-3 فوق السطح من أعلى إلى أسفل ، أو عن طريق تحريك الطبق بحيث يتم إطلاق الأجنة في E-3 المحيط. انقل الأجنة إلى طبق استرداد E-3 بدون MS-222.

لفحص الأجنة باستخدام جهاز PDMS في آبار صفيحة ستة آبار ، استخدم ماصة سعة 1 ، 000 ميكرولتر أو ماصة نقل ضيقة الرأس لتجهيز الجهاز عن طريق تدفق E-3 عبر المنفذ. استخدم E-3 و MS-222 لملء البئر حتى يتم تغطية الجهاز. بعد ذلك ، استخدم ماصة نقل لتوصيل أربعة أجنة تم حقنها مسبقا في كل بئر.

باستخدام حلقة شعر أو أداة مماثلة ، ضع الأجنة عند مداخل قنوات التصوير في الاتجاه المطلوب ، وادفعها جزئيا إلى الجهاز. سيساعد ذلك في جذبهم إلى الجهاز بالتساوي. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر أو ماصة نقل ، ارسم E-3 عبر الجهاز من المنفذ حتى يتم سحب الأجنة إلى القنوات في الاتجاه الصحيح للتصوير.

انقل لوحة البئر إلى مجهر فلوري مقلوب. لتصوير الأجنة ، اضبط التكبير عن طريق تحديد العدسة المناسبة ، مثل 10x لتصوير هجرة أسماك الزرد neturaohil. اضبط شدة مصدر الضوء ووقت التعرض لكل قناة ، بحيث تكون كل إشارة واضحة ، ولكنها غير مشبعة.

أخيرا ، التقط صورا لكل قناة فلورية ومرسلة. باستخدام جهاز القناة المجهرية لتثبيت الأجنة في الاتجاه الجانبي ، تم اختبار قدرة العدلات على الاستجابة للجاذبات الكيميائية القياسية fMLP و LTB4 التي يتم حقنها في الحويصلات الأذنية ، لمدة يومين بعد الإخصاب. لتصور تجنيد العدلات ، تم تتبع الحقن باستخدام رودامين ديكستران عالي الوزن الجزيئي ، وتم إجراؤه في الأجنة المعدلة وراثيا مع عدلات الفلورسنت الخضراء.

تم استخدام الأجنة والأجنة غير المحقونة بالرودامين وحده كعناصر تحكم سلبية. بعد الحقن المجهري ، تم نقل الأجنة إلى جهاز قناة التصوير وتصويرها باستخدام مجهر فلورسنت EVOS بعد 30 دقيقة وخمس ساعات من الحقن. كما هو متوقع ، تم تجنيد عدد صغير من العدلات الفلورية في الحويصلة الأذنية المحقونة الوهمية في وقت مبكر ، على الأرجح بسبب التجنيد بوساطة تالف.

ومن المثير للاهتمام ، أنه لوحظ أن متتبع الرودامين ديكستران يتراكم في الأوتوليث أثناء التجربة. لكل من الجاذبات الكيميائية ، تم تجنيد العدلات بأعداد أكبر ، لا سيما استجابة ل LTB4. بمجرد إتقانها ، يمكن لهذه التقنية أن تحسن بشكل كبير من سرعة ودقة الحقن المجهري لسمك الزرد.

كان تطوير هذه التقنية مدفوعا بتحديات محددة في مختبرنا. لقد قمنا بتحسين هذا النهج ليناسب احتياجات مشاريعنا حول العدوى الفطرية والطعوم الغريبة للورم في نماذج أسماك الزرد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام المصفوفات السطحية المجهرية للحقن المجهري لأسماك الزرد وللتصوير الحي الممتد.