Stereological والتدفق الخلوي توصيف خلايا الدم البيضاء القطعان في نماذج من عابر أو الشلل الدائم نقص التروية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف مجموعات فرعية من الخلايا النخاعية للفأر في الدماغ الإقفاري بمنهجيتين مختلفتين. أولا ، يتم تقديم نموذج دائم لنقص التروية الدماغية عن طريق الانسداد ، سواء الشريان السباتي المشترك أو CCA والجذع البعيد للشريان الدماغي الأوسط أو MCA الذي يولد احتشاء يؤثر بشكل أساسي على قشرة الدماغ. ثم من أجل القياس الكمي المنطقي الاستريو للمجموعات الفرعية للخلايا النخاعية ، فإن الأقسام الإكليلية التسلسلية من الدماغ هي صبغة مناعية للخلايا ذات الأهمية ، ثم يتم قياس الخلايا المتسربة من خلال نهج التجزئة البصرية.

بدلا من ذلك ، يمكن عزل الخلايا النخاعية من أنسجة المخ الطازجة عن طريق التفكك الميكانيكي ، ثم تلطيخها وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. في نهاية المطاف ، يمكن تحقيق القياس الكمي الدقيق والتوصيف النوعي التفصيلي للمجموعات الفرعية المحددة للخلايا النخاعية التي تتسلل إلى دماغ الفأر بعد نقص التروية الدماغية عن طريق القياس الكمي الاستريو وقياس التدفق الخلوي متعدد العوامل على التوالي. الميزة الرئيسية لهذا النموذج التسلسلي لنقص التروية على النموذج التسلسلي الآخر هو أن تقنيتنا لديها معدلات وفيات أقل بكثير من الطرق الأخرى التي تقلل من عدد المطلوبة للدراسة.

هذه المنطقة هي طريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السكتة الدماغية ، مثل ما هي أدوار إعادة التنشيط الجزئي ، أو تسرب الضامة الدموية ، أو العدلات في إصابات الدماغ؟ يمكن أن يوفر القياس الكمي اللاهوتي الدقيق لنهج القياس الخلوي متعدد العوامل الموضحة في هذه الورقة نظرة ثاقبة لعدد النمط الظاهري ووظيفة الخلايا النخاعية في كل من الاستجابة المناعية الفطرية لإقفار CE. لربط CCA أولا ، قم بعمل شق خط الوسط بطول سنتيمتر واحد حول السطح البطني لعنق تحت المجهر الجراحي.

بمجرد تشريحها ، استخدم خياطة من النايلون بستة صفر لسد CCA الأيسر بعقدة دائمة لربط MCA البعيدة. بعد ذلك ، قم بعمل شق أفقي على العضلة الصدغية من اليمين إلى اليسار. ثم قم بعمل شق رأسي ثان على الجانب الأيمن من العضلة الصدغية.

الحرص على تجنب قطع الوريد الصدغي. اسحب العضلة الصدغية بعيدا عن الجمجمة وامسكها بخياطة للحفاظ على سطح جمجمة نظيف. ثم قم بتنظيف الجمجمة بمحلول ملحي معقم بارد للكشف عن الموضع الدقيق ل MCA الأيسر عبر شفافية الجمجمة.

بمجرد تحديد MCA ، استخدم نتوءا من الفولاذ المقاوم للصدأ لإجراء بضع قحف دائري بطول ملليمتر واحد في الفص الجبهي بين القوس الوجني والعظم الحرشفي. قم بإزالة الجمجمة بعناية التي تعرض MCA. ثم استخدم خياطة نايلون من تسعة صفر لسد MCA الأيسر في الجذع البعيد قبل التشعب بين فروع MCA الأمامية والخلفية بعقدة دائمة.

لإزالة الدماغ ، قم بقطع رأس الفأر القتل الرحيم فوق الحبل الشوكي مباشرة وقم بعمل شق أمامي خلفي في الجلد لكشف الجمجمة. ثم قم بعمل قطعتين جانبيتين عند تقاطع الجدران الجانبية وقاعدة الجمجمة وإزالة قطعة العظام الصغيرة. بعد ذلك ، قم بعمل قطع في الجمجمة على طول الخيط السهمي واستخدم ملقطا لإزالة الجمجمة التي تغطي كل نصف كرة لفضح الدماغ.

استخدم ملعقة لفصل الدماغ عن الجمجمة ونقله إلى محلول 4٪ PFA. بعد ثلاث ساعات ، قم بإزالة PFA واحتضان الدماغ في محلول سكروز بنسبة 30٪ لحماية الدماغ بالتبريد. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة محلول السكروز وتجميد الدماغ بسرعة في سالب 40 درجة مئوية isop pentane ثم استخدم ميكروتوم مجمد لعمل أقسام دماغية إكليلية بطول 30 ميكرومتر.

جمع 10 مجموعات تسلسلية في محلول حافظة بالتبريد. تتكون كل مجموعة تسلسلية من حوالي 14 إلى 16 شريحة إكليلية بمسافة بين الشرائح تبلغ 300 ميكرومتر. لضمان أخذ عينات كافية من دماغ الفأر بين 1.94 و سالب 2.46 خلف bgma لتقدير العدد الإجمالي للعدلات المتسللة.

بعد انسداد MCA بواسطة مجزأ بصري ، قم أولا بتلطيخ العدلات مع الجسم المضاد للفئران المضاد LY six G والجسم المضاد الثانوي المناسب على الأقسام العائمة بواسطة تقنية التألق المناعي التقليدية. ثم قم بتركيب أقسام الدماغ على شرائح مجهر الصقيع الفائق مع وضع المنطقة الاحتشائية على اليمين وافتح برنامج محقق الاستريو. بعد ذلك ، انقر فوق قائمة مدير القسم التسلسلي للأدوات وأضف قسما جديدا باستخدام زر القسم الجديد.

اضبط الفاصل الزمني للتقييم على 10 لكسر أخذ عينات شريحة 10. ثم من القائمة المحيطية لأسفل ، حدد أداة كفاف المنطقة الاحتشية. ارسم محيطا لتحديد المنطقة المحتضنة تحت الهدف 10 ×.

ثم قم بالتبديل إلى الهدف 100 × على المجهر وتحت قائمة الهدف. لتحديد كمية العدلات ضمن قائمة المجسات ، حدد الآن المجزأ البصري واضبط موضع XY لإطارات العد على 230 لكل من أحجام الشبكة X و Y. حدد الآن زر العدلات من شريط العلامة وقم بتمييز العدلات الملطخة في المنطقة المحتضنة.

تصدير نتائج القياس الكمي إلى ملف جدول بيانات لفصل الدماغ إلى معلق خلية واحدة. بعد إزالة الدماغ كما هو موضح للتو ، قم بتشريح مناطق القلب ولكل احتشاء من القشرة المماثلة من دماغ فأر إقفاري الدماغ. قم بوزن أنسجة المخ وضعها في خمسة ملليلتر من RPMI المثلج لكل مكالمة للتطبيع بين المجموعات التجريبية ، ثم استخدم مطحنة الأنسجة مع مدقات التفلون لفصل الأنسجة في معلق خلية واحدة.

انقل معلقات الخلية إلى أنبوب طرد مركزي فائق سعة 50 مليلتر وأضف خمسة ملليلتر أخرى من RPMI لكل محلول مكالمة إلى العينات. ثم بعد الطرد المركزي ، يتم تعليق الخلية لمدة 30 دقيقة عند 7 ، 800 GS و 25 درجة مئوية. تأكد من ظهور طبقة بيضاء اللون تتوافق مع المايلين في الجزء العلوي من المحلول.

قم بإزالة طبقة المايلين بعناية وقم بتصفية معلق الخلية بالكامل ، بما في ذلك الخلايا المحببة من خلال مصفاة شبكية من النايلون 40 ميكرومتر. اغسل المصفاة ب 10 ملليلتر من RPMI للتأكد من تصفية جميع الخلايا من خلال الشبكة ، ثم انقل المحلول إلى أنبوب سعة 50 مل. أضف 20 مل من RPMI إلى الخلايا ثم بعد الدوران لأسفل ، أعد تعليق حبيبات الكريات البيض بعد الدوران.

في ملليلتر واحد من PBS ، احتضان الخلايا لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في أربعة ملليلتر من محلول التحلل في درجة حرارة الغرفة لتحلل كريات الدم الحمراء ثم تدوير الخلايا. قم بتسمية الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1٪ BSA والأجسام المضادة المناسبة على الجليد. ثم بعد 45 دقيقة ، اغسل العينات بملليلتر واحد من PBS البارد وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتدفق الفاكس لتحليل قياس التدفق الخلوي.

يتميز هذا النموذج بأحجام احتشاء قابلة للتكرار بدرجة كبيرة في 24 ساعة بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط كما هو مقدر بطريقة كافالييري. في الأقسام الملطخة بالنيال بالاتفاق مع الدراسات السابقة ، يرتبط تسلل العدلات ارتباطا مباشرا بحجم الاحتشاء. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح عزل الكريات البيض وتوصيف التدفق الخلوي بعزل الخلايا النخاعية عن قشرة نصف الكرة الأرضية الآفية IPS للفئران الإقفارية ، والتي تشكل 10 إلى 30٪ من إجمالي الأحداث الموجودة في تعليق الخلية وتقدم معلمة تشتت أمامية منخفضة مرتبطة بالحطام الخلوي.

تتمتع الخلايا الإيجابية CD 11 B بقيمة تشتت أمامية أعلى مما يشير إلى أن بقايا الخلية لم يتم تصنيفه بهذه العلامة وكما هو موضح سابقا ، يمكن استبعاده من مزيد من التحليل عن طريق تحديد عتبة FSC عند 200 عدلات تتميز بأنها LY ست خلايا إيجابية G هي أكثر عدد الخلايا المتسللة التي تم العثور عليها بعد 24 ساعة من انسداد MCA في دماغ الفأر الإقفاري باستخدام هذا النموذج من نقص التروية الدماغية و تشتمل على 70 إلى 80٪ من الخلايا المرتفعة CD 11 B الإيجابية CD 45. تتكون بقية الخلايا في الغالب من مجموعة سكانية فرعية من CD 11 B ، و CD 45 الإيجابي ، و LY ستة G المرتفعة ، وسلوب ستة خلايا وحيدة عالية الالتهابات C ، والتي توجد بأعداد مرتفعة في مناطق الدماغ الإقفارية من 24 إلى 48 ساعة بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط. يمكن تنفيذ نموذج P-M-C-A-O هذا في 30 دقيقة إذا تم إجراؤه بشكل صحيح باتباع إجراء قياس التدفق الخلوي.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل فرز مجموعة فرعية معينة من الخلايا للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما هي أنماط التعبير أو التغيرات الأيضية أو أنشطة الخليك للخلايا النخاعية في هذا النظام النموذجي. بعد مشاهدة هذا الفيديو فقط للحصول على فهم جيد لكيفية إنشاء نموذج نقص التروية والأهم من ذلك ، كيفية توصيف عدد ونمط ظاهري للخلايا النخاعية المتسللة من خلال طريقتين مختلفتين في إصابة دماغ الفأر أو tpe بعد نموذج نقص تروية المخيخ.