عزل خلايا الدماغ والحبل الشوكي وحيدات النوى Percoll باستخدام التدرجات

تتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي أثناء العدوى، أو الإصابات الرضحيّة، أو المناعة الذاتية، أو التنكس العصبي. وبينما يمكن استخدام النهج الكيميائية النسيجية لتحديد موقع الخلايا المتسللة وتحليل الاعتلال المرضي المرتبط بها، إلا أن هذه التقنيات محدودة بعدد الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها في وقت واحد. يتم هنا عرض طريقة للعزل السريع للخلايا وحيدة النواة من أنسجة الدماغ والنخاع الشوكي، حيث يتم أولاً تجنيس النسيج الذي تم تشريحه.

بعد ذلك، يتم إعداد تدرج بيركول (percoll)، وعقب عملية الطرد المركزي، تُجمع الخلايا وحيدة النواة من السطح الفاصل. وأخيراً، تُغسل الخلايا وتُصبغ بالأجسام المضادة. ومن خلال تحليل قياس التدفق الخلوي، يتم التمييز بين الخلايا ذات الأصل الدموي والخلايا الدبقية الصغيرة الرقابية، ويمكن تحديد نسبها النسبية خلال حالات المرض. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل تدرج فيكونسيل (Ficoll gradient) أو الكيمياء النسيجية في أنها تستهلك وقتاً أقل.

يتيح لك ذلك معالجة المزيد من الأنسجة في وقت واحد. سيقوم فني من مختبري بتوضيح كيفية إعداد التدرج وتحضير الكواشف التي ستكون مطلوبة لهذا البروتوكول. نبدأ بأربعة milliliters من محلول isotonic perol المخزون المشار إليه بـ SIP لكل دماغ.

للقيام بذلك، اخلط تسعة أجزاء من perol مع جزء واحد من 10x HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم عن طريق القلب. بعد ذلك، قم بتحضير 70%per call من خلال خلط SIP المُحضر مع 1x HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم وزع 2 mL من 70%per cole في أنبوب مخروطي من البولي بروبيلين سعة 15 mL لجمع الأنسجة.

في هذا الإجراء، ضع الأدمغة والنخاعات الشوكية المستأصلة من جميع فئران الدراسة في دوارق تحتوي على 10 milliliters من وسط RPMI فوق الثلج. بعد ذلك، انقل الأنسجة إلى مجانس (homogenizer) سعة سبعة أو 15 milliliter يحتوي على ثلاثة milliliters من محلول HBSS بتركيز 1× باستخدام مدقة (pestle) ذات مقاس فضفاض لتحضير معلق خلوي بلطف، ثم استبدلها بمدقة من المقاس B ذات ملاءمة محكمة لمزيد من تفكيك الأنسجة.

بمجرد تجنيس النسيج، أضف RPMI أو HBSS بتركيز 1x ليصل الحجم النهائي إلى 7 mL، ثم انتقل إلى مرحلة تحضير تدرج PERCOCO. ابدأ بإضافة 3 mL من SIP إلى معلق الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي من PERCOCO يبلغ 30%. ضع في اعتبارك وجوب استخدام PERCOCO في درجة حرارة الغرفة؛ ففي حال استخدامه بارداً، تميل الخلايا إلى التكتل وتصبح عملية فصل الخلايا أقل كفاءة.

بعد ذلك، وباستخدام مساعد الماصة على وضع الجاذبية، قم بإضافة 10 milliliter من معلق الخلايا ببطء فوق طبقة الـ 70%SIP. تجنب خلط محاليل الـ 70% والـ 30%. تعد هذه الخطوة الأكثر أهمية في الإجراء.

يجب أن يظهر خط مسطح وواضح جداً عند نقطة التقاء المحلولين بتركيز 70% و30%. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن المحلولين الثالث ومحلول 70% قد يختلطان أثناء عملية الطبقات. الخطوة التالية، لضمان استقرار السطح الفاصل، يتم إجراء عملية الطرد المركزي لمدة 30 minutes بسرعة 500 Gs عند درجة حرارة 18 degrees Celsius.

تأكد من أن جهاز الطرد المركزي سيتوقف بفرملة طفيفة أو بدون فرملة لضمان عدم اضطراب السطح البيني. بعد تدوير التدرجات، يجب أن تتراكم طبقة سميكة ولزجة من الحطام عند الجزء العلوي من الأنبوب. الطبقة التالية هي طبقة Percoll بتركيز 30% ذات اللون المائل للاصفرار، والتي قد تحتوي أحياناً على بعض الحطام.

بعد ذلك تأتي الواجهة الفاصلة بين تركيزي 70% و 30%، والتي يجب أن تظهر على شكل هالة بيضاء محددة تحتوي على الخلايا أحادية النواة. وأخيرًا، توجد طبقة Percoll بنسبة 70% الشفافة في قاع الأنبوب. إذا لم يتم ملاحظة الواجهة الفاصلة، فمن المرجح أن يكون عائد الخلايا منخفضًا جدًا، مما يجعل التحليلات اللاحقة صعبة للغاية.

لذلك، في هذه المرحلة، قد تكون هناك حاجة إلى معلقات خلوية جديدة لتقليل التلوث. قم بإزالة طبقة الحطام بعناية من أعلى الأنبوب وتخلص منها. بعد ذلك، وباستخدام ماصة بلاستيكية، اخترق الطبقة العلوية بنسبة 30% واجمع من مليونين إلى ثلاثة ملليلترات من الطور البيني 70 30 وانقلها إلى أنبوب مخروطي نظيف يحتوي على ثمانية ملليلترات من HBSS بتركيز 1×.

امزج الواجهات المخففة بضع مرات عن طريق القلب، ثم قم بالطرد المركزي لمدة سبع دقائق عند 500 GS وبدرجة حرارة 18 درجة مئوية. بعد عملية الطرد، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب. في 1 milliliter من محلول صبغ الخلايا المنظم، انقل معلق الخلايا إلى أنبوب سعة 1.5 milliliter واغسله مرة أخرى.

باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق عند 10,000 GS لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية قبل البدء في صبغ الأجسام المضادة، أعد تعليق الرواسب في 50 µL من anti-US CD 16, CD 32 المنقى والمخفف بنسبة 1 إلى 200 في محلول منظم لصبغ الخلايا لحجب مواقع ارتباط FC. وكما هو الحال في أي إجراء صبغ، من الضروري معايرة جميع الأجسام المضادة بشكل كافٍ، ثم تُحضن على الثلج لمدة 10 دقائق. وأثناء فترة التحضين، اسحب من 2 إلى 5 µL من الخلايا وقم بعدّها باستخدام مقياس كريات الدم (hemo cytometer).

يجب أن تنتج أنسجة الدماغ والنخاع الشوكي السليمة مجتمعة حوالي 3 إلى 5 × 10⁵ خلية لكل فأر. أما الأدمغة الملتهبة فستحتوي على أعداد متفاوتة من الخلايا الالتهابية اعتماداً على النقطة الزمنية التي جُمعت فيها ونموذج المرض. بعد الحضن مع CD 16 وCD 32، أضف 50 µL من مزيج كوكتيل الأجسام المضادة النوعية للخلايا المناعية. يحتوي المزيج المستخدم في هذا المثال على أجسام مضادة ضد CD 45 وCD 4 وCD 19؛ ثم تُحضن العينات على الثلج لمدة 30 دقيقة.

ومن المهم القيام بمعايرة كل جسم مضاد أولاً. ولتقييم التخفيف الأمثل، استخدم تركيبات الفلوروكروم المناسبة المختارة وفقاً لإمكانيات إعدادات الليزر والمرشح الخاصة بجهاز قياس التدفق الخلوي المستخدم. وبعد صبغ الخلايا، اغسلها في محلول صبغ الخلايا عن طريق إضافة 1 mL من محلول صبغ الخلايا وطردها مركزياً لمدة دقيقة واحدة.

بعد عملية الطرد المركزي بسرعة 10,000 Gs، تخلص من المادة الطافية، ثم أعد تعليق الرواسب في 100 إلى 200 µL من محلول صبغ الخلايا المنظم لإجراء تحليل فوري بالتدفق الخلوي أو للتحليل اللاحق. أعد تعليق الخلايا في 2% paraformaldehyde المحضر في PBS واحفظها طوال الليل في درجة حرارة 4 °C. يظهر هنا خلايا وحيدة النواة تم الحصول عليها وحضنها مع FC block، تليها أجسام مضادة لـ anti CD 45 وCD 4 وCD 19.

وفقاً للبروتوكول الموضح، فإن صبغ CD 45 عن طريق قياس التدفق الخلوي يفصل بشكل جيد بين الخلايا المكونة للدم ذات التعبير العالي عن CD 45 والخلايا الدبقية الصغيرة الرقابية ذات التعبير المنخفض (DIM) عن CD 45. تقارن هذه الصورة بين الخلايا المعزولة من دماغ سليم ودماغ ملتهب لفأر تم تحفيزه لتطوير التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي. تظهر شدة CD 45 A PC على المحور Y، حيث يتم تصور ثلاث مجموعات متميزة في الدماغ السليم.

يتم رصد أعداد قليلة جداً من الخلايا ذات التعبير العالي عن CD 45. وعادة ما تكون هذه النسبة أقل من 2% من إجمالي الخلايا المعزولة. وفي المقابل، تُظهر أدمغة الفئران المصابة بـ EAE تدفقاً هائلاً من خلايا الدم المستقطبة إلى الدماغ.

تسمح إضافة علامات أخرى لسطح الخلية مثل CD 11 b وCD four وCD eight وما إلى ذلك، بمزيد من التوصيف لمجتمع CD 45 high. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وأثناء متابعة هذا الإجراء، من المهم تذكر أن النهج النسيجية المقترنة بالتنميط المناعي عن طريق قياس التدفق الخلوي تعد أمرًا بالغ الأهمية للتوصيف الكامل لتكوين الرشاحات الالتهابية في الجهاز العصبي المركزي (CNS).