عزل خلايا الدماغ والحبل الشوكي وحيدات النوى Percoll باستخدام التدرجات

تتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي أثناء العدوى أو الصدمة أو المناعة الذاتية أو التنكس العصبي. بينما يمكن استخدام الأساليب الكيميائية النسيجية لتحديد موقع الخلايا المتسللة وتحليل الأمراض المرتبطة بها ، فإن هذه التقنيات محدودة بعدد الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها في وقت واحد. هنا يتم عرض طريقة للعزل السريع للخلايا أحادية النواة من أنسجة الدماغ والحبل الشوكي حيث يتم تجانس الأنسجة المقطعة أولا.

بعد ذلك ، يتم إعداد تدرج بيرول وبعد الطرد المركزي ، يتم جمع الخلايا أحادية النواة من الواجهة. أخيرا ، يتم شطف الخلايا وتلطيخها بالأجسام المضادة من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي ، يتم تمييز الخلايا الدموية والخلايا الدبقية الصغيرة للمراقبة ويمكن تحديد نسبها النسبية أثناء حالات المرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تدرج Aris أو في مثل هذه الكيمياء النسيجية ، هي أنها تستغرق وقتا أقل.

هذا يسمح لك بمعالجة المزيد من الأنسجة في نفس الوقت. سيظهر إعداد التدرج هو بالينو فني من مختبري قم بإعداد الكواشف التي ستكون مطلوبة لهذا البروتوكول. بدءا من أربعة ملليلتر من المخزون البيرول متساوي التوتر يشار إليه باسم SIP لكل دماغ.

للقيام بذلك ، امزج تسعة أجزاء من البيرول مع جزء واحد 10 مرات HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم الممزوج بالانقلاب. بعد ذلك ، قم بإعداد 70٪ لكل مكالمة أثناء خلط SIP المحضر مع HBSS مرة واحدة بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم قم بتوزيع ملليلترين من 70٪ لكل كول في أنبوب مخروطي بولي بروبيلين سعة 15 مليلتر لجمع الأنسجة.

في هذا الإجراء ، ضع الأدمغة والحبال الشوكية المقطوعة لجميع فئران الدراسة في أكواب تحتوي على 10 ملليلتر من RPMI فوق الجليد. بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى الخالط السفلي سعة سبعة أو 15 مليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من مرة واحدة HBSS بحجم مناسب فضفاض. تقوم المدقة بعمل تعليق خلوي برفق ، ثم تتحول إلى مدقة ضيقة الحجم B ، وتزيد من فصل الأنسجة.

بمجرد تجانس الأنسجة ، أضف RPMI أو مرة واحدة HBSS إلى الحجم النهائي البالغ سبعة ملليلتر واستمر في إعداد التدرج لإعداد تدرج البركوك. ابدأ بإضافة ثلاثة ملليلتر من SIP إلى تعليق الخلية إلى تركيز PERCOCO النهائي بنسبة 30٪ ضع في اعتبارك أنه يجب استخدام البيرول في درجة حرارة الغرفة. إذا تم استخدامه باردا ، تميل الخلايا إلى التكتل ويكون فصل الخلايا أقل كفاءة.

بعد ذلك، باستخدام وضع ضبط الجاذبية لمساعد الماصة، ضع طبقة ببطء من معلق الخلية سعة 10 ملليلتر فوق 70٪ SIP. تجنب خلط المحاليل 70٪ و 30٪. هذه هي الخطوة الأكثر أهمية في الإجراء.

يجب أن يكون الخط المسطح الواضح جدا مرئيا عند تقاطع 70 إلى 30٪. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الحلول الثالثة و 70٪ ستختلط أثناء الطبقات. الخطوة التالية ، المساومة على جهاز الطرد المركزي للواجهة 30 دقيقة من 500 جي ثانية عند 18 درجة مئوية.

تأكد من توقف جهاز الطرد المركزي بأقل قدر من الانقطاع أو بدون انقطاع حتى لا يتم إزعاج الواجهة. بعد تدوير التدرجات ، يجب أن تتراكم طبقة سميكة ولزجة من الحطام في الجزء العلوي من الأنبوب. الطبقة التالية هي 30٪ الصفراء لكل طبقة أساسية ، والتي تحتوي أحيانا على الحطام.

التالي هو الواجهة من 70 إلى 30 ، والتي يجب أن تحتوي على هالة بيضاء محددة وتحتوي على خلايا أحادية النواة. أخيرا ، يوجد في الجزء السفلي من الأنبوب طبقة البيرول الشفافة بنسبة 70٪. إذا لم يتم ملاحظة أي واجهة ، فمن المحتمل أن يكون إنتاجية الخلايا منخفضة جدا ، مما يجعل المزيد من التحليل صعبا للغاية.

لذلك ، في هذه المرحلة ، قد تكون هناك حاجة إلى تعليق خلوي جديد لتقليل التلوث. قم بإزالة طبقة الحطام بعناية من أعلى الأنبوب وتخلص منها. ثم باستخدام ماصة بلاستيكية ، انتقل عبر أعلى 30٪ لكل طبقة أساسية واجمع ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من الطور البيني 70 30 وانقلها إلى أنبوب مخروطي نظيف يحتوي على ثمانية ملليلتر من واحد مرات HBSS.

امزج الواجهات المخففة عدة مرات عن طريق الانعكاس ، ثم جهاز الطرد المركزي لمدة سبع دقائق عند 500 GS عند 18 درجة مئوية. بعد الدوران ، قم بإزالة supena وإعادة تعليق الحبيبات. في مليلتر واحد من المخزن المؤقت لتلوين الخلايا ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر واغسله مرة أخرى.

باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق عند 10 ، 000 GS لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية قبل الشروع في تلطيخ الأجسام المضادة لإجراء تلطيخ الأجسام المضادة ، قم بتعليق الكريات في 50 ميكرولترا من CD 16 ، CD 32 المنقى المضاد للولايات المتحدة ، المخفف من واحد إلى 200 في المخزن المؤقت لتلوين الخلية لمنع مواقع ربط FC. بالنسبة لأي إجراء تلطيخ ، من الضروري أن يتم معايرة جميع الأجسام المضادة بشكل كاف وتحتضن على الجليد لمدة 10 دقائق. أثناء الحضانة ، قم بإزالة ليلترين إلى خمسة ميكرولتر من الخلايا وقم بحسابها باستخدام مقياس الخلوي الدموي.

يجب أن تنتج أنسجة الدماغ والحبل الشوكي الساذجة مجتمعة حوالي ثلاثة إلى خمسة أضعاف 10 للخلايا الخمس لكل فأر. سيكون للأدمغة الملتهبة أعداد تتراوح من الخلايا الالتهابية اعتمادا على النقطة الزمنية التي يتم فيها جمعها ونموذج المرض بعد الحضانة باستخدام CD 16 و CD 32 ، أضف 50 ميكرولترا من مزيج كوكتيل الأجسام المضادة الخاصة بالخلايا المناعية. يحتوي المزيج المستخدم في هذا المثال على أجسام مضادة ضد CD 45 و CD Four و CD 19 تحتضن على الجليد لمدة 30 دقيقة.

الأهم من ذلك ، يجب معايرة كل جسم مضاد أولا. لتقييم التخفيف الأمثل ، استخدم مجموعات الفلوروكروم المناسبة المختارة وفقا لإمكانيات الليزر وإعدادات المرشح للتدفق الخاص بك. مقياس الخلايا ، بعد تلطيخ الخلايا ، غسلها في مخزن تلطيخ الخلايا عن طريق إضافة مليلتر واحد من المخزن المؤقت لتلوين الخلايا وتدويرها لمدة دقيقة واحدة.

عند 10 ، 000 Gs بعد الدوران ، تخلص من عامل الاستلقاء ، ثم أعد تعليق المنصات في 100 إلى 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلوين الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي الفوري لتحليله لاحقا. يقوم Reus بتعليق الخلايا في 2٪ من الفورمالديهايد المحضر في PBS وتخزينه طوال الليل عند أربع درجات مئوية. تظهر هنا خلايا أحادية النواة تم الحصول عليها وتحضنها باستخدام كتلة FC ، تليها الأجسام المضادة ل CD 45 و CD four و CD 19.

وفقا للبروتوكول الواضح عن طريق قياس التدفق الخلوي CD 45 تلطيخ بشكل جيد يفصل CD 45 خلايا دموية عالية من CD 45 ، DIM مراقبة microglia. يقارن هذا الشكل الخلايا المعزولة عن الساذج والدماغ الملتهب من الفأر الذي تم إحداثه لتطوير التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي. CD 45 تظهر شدة الكمبيوتر الشخصي على المحور Y حيث يتم تصور ثلاثة مجموعات متميزة في الدماغ الساذج.

تم الكشف عن عدد قليل جدا من الخلايا العالية CD 45. عادة أقل من 2٪ من إجمالي السكان المعزولين. بالمقارنة ، تظهر أدمغة الفئران المصابة ب EAE تدفقا هائلا لخلايا الدم المجندة في الدماغ.

إضافة علامات أخرى على سطح الخلية مثل CD 11 b و CD four و CD eight وما إلى ذلك ، بمزيد من التوصيف لعدد السكان المرتفعين CD 45 بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء حضور هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الأساليب النسيجية جنبا إلى جنب مع التنميط الظاهري المناعي عن طريق قياس التدفق الخلوي ضرورية لتوصيف تكوين التسللات الالتهابية للجهاز العصبي المركزي بشكل كامل.