Name: عزل خلايا الدماغ والحبل الشوكي وحيدات النوى Percoll باستخدام التدرجات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: تعلم عزل الخلايا وحيدات النوى من دماغ ونخاع الفأر باستخدام تدرجات Percoll. تتيح هذه الطريقة السريعة تحليل المناعة بالتدفق السيتومتري لدراسة اختراق الخلايا المناعية للجهاز العصبي المركزي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل الجمعية الوطنية لمرض التصلب العصبي المتعدد (TA 3021 - A1 / T لAEC) وجامعة تكساس في سان انطونيو.

إعداد الكواشف إعداد المخزون متساوي التوتر percoll (SIP) ، و 4 مل في المخ ، عن طريق خلط 9 أجزاء من percoll مع جزء واحد من دون HBSS 10X الكالسيوم والمغنيسيوم + + + +. إعداد المسبار في 70 ٪ في 1X HBSS دون الكالسيوم والمغنيسيوم + + + + ، 2 مل في الدماغ الاستغناء في أنبوب 15 مل المخروطية البولي بروبلين. ملاحظة : من المستحسن أن تستخدم percoll في درجة حرارة الغرفة ، إذا ما استخدمت الباردة ، وتميل إلى الخلايا تتجمع وفصل الخلية هو أقل كفاءة. جمع الأنسجة والتجانس تخدير الفئران ويروي من خلال البطين الأيسر مع الثلج الباردة HBSS 1X. تشريح الدماغ والحبل الشوكي والمحافظة في RPMI دون الحمراء الفينول حتى يتم التضحية جميع الفئران. الأنسجة مكان في 7 أو 15 مل dounce الخالط تحتوي على 3 مل من RPMI ، وجعل بلطف تعليق خلية مع مدقة فضفاضة (A الحجم) تليها مدقة tigh تركيب (B حجم) لمزيد من فصل الأنسجة. إكمال حجم الخلية تعليق إلى 7 مل مع RPMI. مجموعة متدرجة تصل أضف 3 مل من SIP إلى تعليق خلية لجعل SIP النهائي 30 ٪ طبقة الخلايا ببطء تعليق 10 مل على رأس SIP 70 ٪. هذه هي الخطوة الأكثر أهمية من هذا الإجراء ، استخدم ماصة المساعدات المنصوص عليها في وضع الجاذبية تجنب الاختلاط بين 70 ٪ و 30 ٪ الحلول. وينبغي أن يكون خط واضح جدا شقة تكون مرئية عند تقاطع 70 ٪ -30 ٪. الطرد المركزي و 30 دقيقة في 500G 18 درجة مئوية. تأكد من أجهزة الطرد المركزي ستتوقف مع الفرامل ضئيلة جدا أو معدومة بحيث لا بالانزعاج الطور البيني. باستخدام الماصة نقل وإزالة برفق طبقة من الأنقاض من أعلى الأنبوب ، وجمع 2،0-3،0 مل من الطور البيني بنسبة 70 ٪ -30 ٪ في أنبوب مخروطي نظيفة تحتوي على 8 مل من 1X HBSS. ضمان تضعف percoll تحتوي على نحو ثلاثة أضعاف الطور البيني ، مزيج عدة مرات من قبل وانعكاس centrifugre دقيقة 7 في 500G في 18 درجة مئوية. Resuspend بيليه في 1 مل من العازلة تلطيخ الخلايا وتحويلها إلى أنبوب 1.5 مل ، ويغسل مرة أخرى باستخدام جهاز للطرد المركزي في الدقيقة 10000 دقيقة 1 G في 4 درجات مئوية. الأضداد تلطيخ المخفف الكريات Resuspend في 50 ميكرولتر من المنقى antimouse CD16/CD32 1:200 العازلة في تلوين الخلية لمنع المواقع التيسير ملزمة. احتضان أكثر من الثلج لمدة 10 دقيقة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. إضافة 50 ميكرولتر مزيج الكوكتيل الأضداد واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. يجب أن تكون كل الأجسام المضادة معاير الأولى لتقييم التخفيف الأمثل. ملون تألقي استخدام تركيبات مناسبة اختيارها وفقا لقدرات الليزر وإعدادات التصفية من عداد الكريات الخاص تدفق معين. غسل الخلايا في خلية تلوين العازلة ، والكريات resuspend 100-200 في ميكرولتر من تلطيخ العازلة الخلية وتحليلها على الفور في عداد الكريات ، أو بدلا من ذلك يمكن أن يكون معلق الخلايا في بارافورمالدهيد 2 ٪ (PFA) الذي أعد في برنامج تلفزيوني وتخزينها خلال الليل في 4 درجات مئوية . ممثل النتائج : بعد الغزل التدرجات ، ينبغي أن 70 ٪ -30 ٪ الطور البيني لديها هالة المعرفة البيضاء ، والكميات من الخلايا المستخرجة من السذاجة ماوس ينبغي ان تسفر 3-5 X10 5 خلايا في الماوس (الدماغ بالاضافة الى النخاع الشوكي). قد يكون التهاب الدماغ تتراوح أعداد الخلايا الالتهابية تبعا للإهانة أو نموذج المرض الجهاز العصبي المركزي (الشكل 1). <img src="/files/ftp_upload/2348/2348fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. عزل الخلايا وحيدة النواة ، من السذاجة وEAE المخ في مرض الذروة. تم فصل الخلايا في الدماغ أكثر من المعلقات متقطع 70 ٪ / 30 ٪ percoll التدرجات. وحضنت الخلايا ملطخة FC - تليها كتلة مضادة للCD45 الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة على الجليد. وتشطف الخلايا في خلية تلوين العازلة ، والثابتة في اقتناء PFA 2 ٪ قبل LSR في الثاني. ويتم قياس كثافة CD45 في المحور Y ، حيث ثلاث مجموعات متميزة هي تصور. ويتم تنفيذ مزيد من توصيف النمط الظاهري المناعي للخلايا CD45 التسلل مرحبا به الأضداد إضافية وتحليلها لاحقا من قبل التدفق الخلوي.

<ol><li>Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Juedes, A. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+infiltrating+central+nervous+system+APCs+regulate+the+emergence+and+resolution+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tickets+to+the+brain%3A+Role+of+CCR2+and+CX%283%29CR1+in+myeloid+cell+entry+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS.</a> J Neuroimmunol. , (2010).</li>
<li>Mildner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).</li>
<li>Djukic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+monocytes+engraft+in+the+brain%2C+differentiate+into+microglia+and+contribute+to+the+pathology+following+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice.</a> Brain. 129, 2394-2403 (2006).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد استخدمت تحليلات علامات سطح الخلية في الجهاز العصبي المركزي الكريات البيض من الأنسجة الملتهبة والفأر العادي لعدة عقود 1-3. وتستند بروتوكولات العزل في فصل الخلايا الدبقية الصغيرة والكريات البيض بنسبة 4 الطرد المركزي الكثافة. نحن هنا وصف طريقة سريعة وفعالة لعزل الجهاز العصبي المركزي الكريات البيض باستخدام التدرجات percoll متقطع. بعد عزل الخلايا ، وتلطيخ مع أضداد مختلفة مثل ، ولكن ليس على سبيل الحصر ، CD45 ، CD4 ، CD8 ، CD11b ، CD19 ، وما إلى ذلك يسمح بتحديد ...

تجانس الأنسجة والتدرجات <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Percoll (أمرشام) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هانكس 10X &quot;محلول الملح المتوازن ، دون الكالسيوم والمغنيسيوم (Gibco) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI متوسطة 1640 ، دون أحمر الفينول (Gibco) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 مل أو 15 مل Dounce المطاحن الأنسجة (VWR) </li></ul> التدفق الخلوي <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلية يلطخ العازلة (Biolegend) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منقى لمكافحة فأر CD16/CD32 ماوس (الفأرة دينار بحريني التيسير بلوك) ، BD Pharmingen </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدادة الكريات (فيشر) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكافحة فأر CD45 (استنساخ 30 - F11) ، CD4 (استنساخ RM4 - 5) ، CD19 (استنساخ 6D5) ، BioLegend </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخزين المؤقت الفوسفات 10X المالحة ، دون الكالسيوم والمغنيسيوم (الحرارية العلمية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بارافورمالدهيد (سيغما الدريتش) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل التدفق الخلوي يؤديها مع الثاني LSR دينار بحريني (العلوم البيولوجية) </li></ul>

عزل خلايا الدماغ والحبل الشوكي وحيدات النوى percoll باستخدام التدرجات

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

مطلوب في كثير من الأحيان عزل الخلايا المناعية التي التسلل الى الجهاز العصبي المركزي (CNS) خلال والعدوى المناعة الذاتية ، والصدمات النفسية أو تنكس عصبي ، لتحديد النمط الظاهري ووظائفها المستجيب. النهج النسيجية هي مفيدة لتحديد موقع الخلايا والتسلل لتحليل الجهاز العصبي المركزي المرتبطة الأمراض. ومع ذلك ، محدودة في الموضع الكيمياء النسيجية وتقنيات التلوين مناعي من قبل عدد من الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها في وقت واحد لتميز فرعية الخلايا المناعية في نسيج معين. ولذلك ، والنهج النسيجية بالتعاون مع phenotyping المناعة بواسطة التدفق الخلوي حاسمة لتوصيف كامل لتكوين تسلل CNS المحلية. ويستند هذا البروتوكول على الفصل بين الجهاز العصبي المركزي التعليق على مدى الخلوية التدرجات percoll discontinous. المقالة الحالية يصف بروتوكول السريع لعزل خلايا وحيدات النوى بكفاءة من أنسجة الحبل الشوكي والدماغ التي يمكن استخدامها بشكل فعال لتحديد مختلف السكان الخلايا المناعية في عينة واحدة بواسطة التدفق الخلوي.

المقالة الحالية يصف بروتوكول السريع لعزل خلايا وحيدات النوى بكفاءة من أنسجة الحبل الشوكي والدماغ التي يمكن استخدامها بشكل فعال لتحليل تدفق cytometric.

عزل خلايا الدماغ والحبل الشوكي وحيدات النوى Percoll باستخدام التدرجات

غالباً ما تكون عملية عزل الخلايا المناعية التي تتسلل إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) أثناء العدوى أو الإصابة أو المناعة الذاتية أو التنكس العصبي مطلوبة...

تتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي أثناء العدوى، أو الإصابات الرضحيّة، أو المناعة الذاتية، أو التنكس العصبي. وبينما يمكن استخدام النهج الكيميائية النسيجية لتحديد موقع الخلايا المتسللة وتحليل الاعتلال المرضي المرتبط بها، إلا أن هذه التقنيات محدودة بعدد الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها في وقت واحد. يتم هنا عرض طريقة للعزل السريع للخلايا وحيدة النواة من أنسجة الدماغ والنخاع الشوكي، حيث يتم أولاً تجنيس النسيج الذي تم تشريحه.بعد ذلك، يتم إعداد تدرج بيركول (percoll)، وعقب عملية الطرد المركزي، تُجمع الخلايا وحيدة النواة من السطح الفاصل. وأخيراً، تُغسل الخلايا وتُصبغ بالأجسام المضادة. ومن خلال تحليل قياس التدفق الخلوي، يتم التمييز بين الخلايا ذات الأصل الدموي والخلايا الدبقية الصغيرة الرقابية، ويمكن تحديد نسبها النسبية خلال حالات المرض. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل تدرج فيكونسيل (Ficoll gradient) أو الكيمياء النسيجية في أنها تستهلك وقتاً أقل.يتيح لك ذلك معالجة المزيد من الأنسجة في وقت واحد. سيقوم فني من مختبري بتوضيح كيفية إعداد التدرج وتحضير الكواشف التي ستكون مطلوبة لهذا البروتوكول. نبدأ بأربعة milliliters من محلول isotonic perol المخزون المشار إليه بـ SIP لكل دماغ.للقيام بذلك، اخلط تسعة أجزاء من perol مع جزء واحد من 10x HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم عن طريق القلب. بعد ذلك، قم بتحضير 70%per call من خلال خلط SIP المُحضر مع 1x HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم وزع 2 mL من 70%per cole في أنبوب مخروطي من البولي بروبيلين سعة 15 mL لجمع الأنسجة.في هذا الإجراء، ضع الأدمغة والنخاعات الشوكية المستأصلة من جميع فئران الدراسة في دوارق تحتوي على 10 milliliters من وسط RPMI فوق الثلج. بعد ذلك، انقل الأنسجة إلى مجانس (homogenizer) سعة سبعة أو 15 milliliter يحتوي على ثلاثة milliliters من محلول HBSS بتركيز 1× باستخدام مدقة (pestle) ذات مقاس فضفاض لتحضير معلق خلوي بلطف، ثم استبدلها بمدقة من المقاس B ذات ملاءمة محكمة لمزيد من تفكيك الأنسجة.بمجرد تجنيس النسيج، أضف RPMI أو HBSS بتركيز 1x ليصل الحجم النهائي إلى 7 mL، ثم انتقل إلى مرحلة تحضير تدرج PERCOCO. ابدأ بإضافة 3 mL من SIP إلى معلق الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي من PERCOCO يبلغ 30%. ضع في اعتبارك وجوب استخدام PERCOCO في درجة حرارة الغرفة؛ ففي حال استخدامه بارداً، تميل الخلايا إلى التكتل وتصبح عملية فصل الخلايا أقل كفاءة.بعد ذلك، وباستخدام مساعد الماصة على وضع الجاذبية، قم بإضافة 10 milliliter من معلق الخلايا ببطء فوق طبقة الـ 70%SIP. تجنب خلط محاليل الـ 70% والـ 30%. تعد هذه الخطوة الأكثر أهمية في الإجراء.يجب أن يظهر خط مسطح وواضح جداً عند نقطة التقاء المحلولين بتركيز 70% و30%. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن المحلولين الثالث ومحلول 70% قد يختلطان أثناء عملية الطبقات. الخطوة التالية، لضمان استقرار السطح الفاصل، يتم إجراء عملية الطرد المركزي لمدة 30 minutes بسرعة 500 Gs عند درجة حرارة 18 degrees Celsius.تأكد من أن جهاز الطرد المركزي سيتوقف بفرملة طفيفة أو بدون فرملة لضمان عدم اضطراب السطح البيني. بعد تدوير التدرجات، يجب أن تتراكم طبقة سميكة ولزجة من الحطام عند الجزء العلوي من الأنبوب. الطبقة التالية هي طبقة Percoll بتركيز 30% ذات اللون المائل للاصفرار، والتي قد تحتوي أحياناً على بعض الحطام.بعد ذلك تأتي الواجهة الفاصلة بين تركيزي 70% و 30%، والتي يجب أن تظهر على شكل هالة بيضاء محددة تحتوي على الخلايا أحادية النواة. وأخيرًا، توجد طبقة Percoll بنسبة 70% الشفافة في قاع الأنبوب. إذا لم يتم ملاحظة الواجهة الفاصلة، فمن المرجح أن يكون عائد الخلايا منخفضًا جدًا، مما يجعل التحليلات اللاحقة صعبة للغاية.لذلك، في هذه المرحلة، قد تكون هناك حاجة إلى معلقات خلوية جديدة لتقليل التلوث. قم بإزالة طبقة الحطام بعناية من أعلى الأنبوب وتخلص منها. بعد ذلك، وباستخدام ماصة بلاستيكية، اخترق الطبقة العلوية بنسبة 30% واجمع من مليونين إلى ثلاثة ملليلترات من الطور البيني 70 30 وانقلها إلى أنبوب مخروطي نظيف يحتوي على ثمانية ملليلترات من HBSS بتركيز 1×.امزج الواجهات المخففة بضع مرات عن طريق القلب، ثم قم بالطرد المركزي لمدة سبع دقائق عند 500 GS وبدرجة حرارة 18 درجة مئوية. بعد عملية الطرد، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب. في 1 milliliter من محلول صبغ الخلايا المنظم، انقل معلق الخلايا إلى أنبوب سعة 1.5 milliliter واغسله مرة أخرى.باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق عند 10,000 GS لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية قبل البدء في صبغ الأجسام المضادة، أعد تعليق الرواسب في 50 µL من anti-US CD 16, CD 32 المنقى والمخفف بنسبة 1 إلى 200 في محلول منظم لصبغ الخلايا لحجب مواقع ارتباط FC. وكما هو الحال في أي إجراء صبغ، من الضروري معايرة جميع الأجسام المضادة بشكل كافٍ، ثم تُحضن على الثلج لمدة 10 دقائق. وأثناء فترة التحضين، اسحب من 2 إلى 5 µL من الخلايا وقم بعدّها باستخدام مقياس كريات الدم (hemo cytometer).يجب أن تنتج أنسجة الدماغ والنخاع الشوكي السليمة مجتمعة حوالي 3 إلى 5 × 10⁵ خلية لكل فأر. أما الأدمغة الملتهبة فستحتوي على أعداد متفاوتة من الخلايا الالتهابية اعتماداً على النقطة الزمنية التي جُمعت فيها ونموذج المرض. بعد الحضن مع CD 16 وCD 32، أضف 50 µL من مزيج كوكتيل الأجسام المضادة النوعية للخلايا المناعية. يحتوي المزيج المستخدم في هذا المثال على أجسام مضادة ضد CD 45 وCD 4 وCD 19؛ ثم تُحضن العينات على الثلج لمدة 30 دقيقة.ومن المهم القيام بمعايرة كل جسم مضاد أولاً. ولتقييم التخفيف الأمثل، استخدم تركيبات الفلوروكروم المناسبة المختارة وفقاً لإمكانيات إعدادات الليزر والمرشح الخاصة بجهاز قياس التدفق الخلوي المستخدم. وبعد صبغ الخلايا، اغسلها في محلول صبغ الخلايا عن طريق إضافة 1 mL من محلول صبغ الخلايا وطردها مركزياً لمدة دقيقة واحدة.بعد عملية الطرد المركزي بسرعة 10,000 Gs، تخلص من المادة الطافية، ثم أعد تعليق الرواسب في 100 إلى 200 µL من محلول صبغ الخلايا المنظم لإجراء تحليل فوري بالتدفق الخلوي أو للتحليل اللاحق. أعد تعليق الخلايا في 2% paraformaldehyde المحضر في PBS واحفظها طوال الليل في درجة حرارة 4 °C. يظهر هنا خلايا وحيدة النواة تم الحصول عليها وحضنها مع FC block، تليها أجسام مضادة لـ anti CD 45 وCD 4 وCD 19.وفقاً للبروتوكول الموضح، فإن صبغ CD 45 عن طريق قياس التدفق الخلوي يفصل بشكل جيد بين الخلايا المكونة للدم ذات التعبير العالي عن CD 45 والخلايا الدبقية الصغيرة الرقابية ذات التعبير المنخفض (DIM) عن CD 45. تقارن هذه الصورة بين الخلايا المعزولة من دماغ سليم ودماغ ملتهب لفأر تم تحفيزه لتطوير التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي. تظهر شدة CD 45 A PC على المحور Y، حيث يتم تصور ثلاث مجموعات متميزة في الدماغ السليم.يتم رصد أعداد قليلة جداً من الخلايا ذات التعبير العالي عن CD 45. وعادة ما تكون هذه النسبة أقل من 2% من إجمالي الخلايا المعزولة. وفي المقابل، تُظهر أدمغة الفئران المصابة بـ EAE تدفقاً هائلاً من خلايا الدم المستقطبة إلى الدماغ.تسمح إضافة علامات أخرى لسطح الخلية مثل CD 11 b وCD four وCD eight وما إلى ذلك، بمزيد من التوصيف لمجتمع CD 45 high. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وأثناء متابعة هذا الإجراء، من المهم تذكر أن النهج النسيجية المقترنة بالتنميط المناعي عن طريق قياس التدفق الخلوي تعد أمرًا بالغ الأهمية للتوصيف الكامل لتكوين الرشاحات الالتهابية في الجهاز العصبي المركزي (CNS).

isolation-brain-spinal-cord-mononuclear-cells-using-percoll

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

نحن في هذا الفيديو لشرح كيفية عزل الخلايا وحيدة النواة من الجهاز العصبي المركزي من الدماغ و النخاع الذاتية مع الفئران المختبرية.

عزل خلايا وحيدات النوى من الجهاز العصبي المركزي مع الجرذان EAE

هنا نقدم وسيلة لعزل الخلايا العصبية والثقافة الخلايا الحبيبية والخلايا العصبية للدماغ السلف الحبيبية للدماغ الفأر من بعد الولادة.

العزلة وثقافة ما بعد الولادة ماوس مخيخي الخلايا الحبيبية السلف الخلية العصبية والخلايا العصبية

ووصف طريقة سريعة للحصول على الكريات البيض التسلل من الدماغ الفئران. هذه الطريقة تستخدم الانحدار المستمر والمتقطع Percoll التدرج Ficoll لتحديد وتنقية طبقة الكريات البيض المخصب. ثم قد تكون معزولة الكريات البيضاء التي تتميز قياسات تدفق cytometric.

عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل

في هذا الفيديو ، نقوم بعزل الخلايا أحادية النواة من دماغ الفأر باستخدام الطرد المركزي المتدرج للكثافة. يمكن استخدام تعليق الخلية أحادية النواة المعزول لمزيد من التحليل النهائي.

عزل الخلايا أحادية النواة عن دماغ الفأر: تقنية الطرد المركزي المتدرج للكثافة لعزل الخلايا أحادية النواة المقيمة في الدماغ

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكولا خطوة بخطوة لعزل الخلايا العصبية في الحبل الشوكي من فأر حديثي الولادة للدراسات في المختبر.

عزل الخلايا العصبية في الحبل الشوكي: إجراء تدرج الكثافة لعزل الخلايا العصبية في الحبل الشوكي لحديثي الولادة للدراسات في المختبر

يوضح الفيديو عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المتسللة إلى الورم من دماغ الفأر باستخدام التفكك الميكانيكي والهضم الأنزيمي. يتبع ذلك الطرد المركزي المتدرج للكثافة لجمع الخلايا المناعية لمزيد من التحليل.

عزل الخلايا المناعية المتسللة للورم من دماغ الفئران

يوضح الفيديو تحضير معلق أحادي الخلية للخلايا المناعية من أنسجة دماغ الفئران. يتضمن الهضم الأنزيمي لإطلاق الخلايا من أنسجة المخ ، يليه الطرد المركزي المتدرج للكثافة لعزل الخلايا المناعية بناء على كثافتها للحصول على تعليق الخلية الواحدة.

تحضير معلق أحادي الخلية للخلايا المناعية من أنسجة دماغ الفئران

يوضح هذا الفيديو تقنية لعزل واستزراع الخلايا الدبقية الأولية المختلطة من أنسجة الحبل الشوكي للفأر البالغ. يتضمن البروتوكول الهضم الأنزيمي للأنسجة ، متبوعا بإزالة أغشية الخلايا المكسورة وحطام المايلين للحصول على مجموعة من خلية واحدة. ثم يتم زراعة الخلايا في وسائط محسنة لنمو الخلايا الدبقية المختلطة.

إنشاء مزارع الخلايا الدبقية المختلطة الأولية من الحبل الشوكي للفأر

ويرد بروتوكول لعزل microglia الأولية من العقول مورين. يساعد هذا الأسلوب في الفهم الحالي للظروف العصبية. يتم الجمع بين الكثافة المتدرجة الطرد المركزي والفصل المغناطيسي لإنتاج المحصول كافياً من عينة نقية جداً. وعلاوة على ذلك، فإننا مخطط الخطوات اللازمة لتوصيف microglia.

توصيف والعزلة للماوس Microglia الأولية بكثافة التدرج الطرد المركزي

تقدم هذه الورقة بروتوكولين محسنين لفحص الخلايا المناعية المقيمة والمشتقة من المحيط داخل الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك الدماغ والحبل الشوكي والسحايا. يساعد كل من هذه البروتوكولات على التأكد من وظيفة وتكوين الخلايا التي تشغل هذه المقصورات في ظل حالة مستقرة وظروف التهابية.

عزل أنسجة الجهاز العصبي المركزي والسحايا المرتبطة به لتحليل المصب للخلايا المناعية

حتى الآن ، تعد بروتوكولات العزل المتزامن لجميع أنواع الخلايا الرئيسية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي من نفس الفأر طلبا غير ملباة. يظهر البروتوكول إجراء قابلا للتطبيق في الفئران الساذجة والتجريبية لالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي للتحقيق في الشبكات الخلوية المعقدة أثناء الالتهاب العصبي وتقليل أعداد الفئران المطلوبة في نفس الوقت.

العزل المتزامن لأنواع الخلايا المقيمة في الجهاز العصبي المركزي الرئيسي من الفئران المصابة بالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي للبالغين

تعلم عزل الخلايا وحيدات النوى من دماغ ونخاع الفأر باستخدام تدرجات Percoll. تتيح هذه الطريقة السريعة تحليل المناعة بالتدفق السيتومتري لدراسة اختراق الخلايا المناعية للجهاز العصبي المركزي.

عزل خلايا الدماغ والحبل الشوكي وحيدات النوى Percoll باستخدام التدرجات

استكشف المزيد من الفيديوهات