التدخل RNA اليرقات في الأحمر خنفساء الدقيق، كونفيوسم كاستانيم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تدمير جين مثير للاهتمام عن طريق تداخل الحمض النووي الريبي في خنفساء الزهرة الحمراء ثلاثية الكاديوم عن طريق حقن محلول الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في تجويف جسم اليرقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل المرحلة المناسبة من اليرقات أولا عن الثقافة عن طريق غربلة زهرة الثقافة وفصل اليرقات عن المراحل الأخرى من الخنافس في وعاء البذور. الخطوة الثانية هي تحضير إبرة الحقن عن طريق كسر طرف الإبرة ، ووضعها على حامل إبرة وتحميل أمامي ، محلول RNA مزدوج تقطعت به السبل بالتركيز المطلوب في الإبرة.

بعد ذلك ، قم بتفويض اليرقات المعزولة وضع اليرقات على شريحة زجاجية لزجة. الخطوة الأخيرة هي حقن اليرقات بمحلول RNA مزدوج تقطعت بهم السبل تحت مجهر تشريح. في النهاية ، يتم تحليل الأنماط الظاهرية المرتبطة ب RNAi في المرحلة المرغوبة لتحديد وظيفة الجين المستهدف.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية ، مثل تكوين الخلايا العصبية أو التحول ، هي أن مجرد حقن بسيط لمحلول الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في تجويف جسم الخنافس يمكن أن يؤدي إلى ضربة قاضية جينية فعالة وطويلة الأمد في أي مرحلة مرغوبة من تطور البيدو. على الرغم من أن البروتوكول الموصوف هنا سيركز على يرقات الكاستين الثلاثية مع بعض التعديل ، إلا أنه يمكن تطبيق إجراءات الحقن على مراحل أخرى من التريوم والكاستين والحشرات الأخرى. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة من أجل صنع إبرة جيدة وحقن الكمية المناسبة من محلول الحمض النووي الريبي المزدوج دون قتل اليرقات.

العرض المرئي لهذه التقنية أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب وصف حقن الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل وخطوات تحضير الإبرة ولا يمكن تعلمها إلا من خلال الملاحظة وممارسة الثقافة. سلالة الشاي المصبوبة كما هو مفصل في بروتوكول النص المصاحب. أفرغ زجاجة واحدة من الخنافس على غربال رقم 25 على الفور ونخلها بقوة لجمع اليرقات الأكبر سنا والشرانة والبالغين.

ثم انقل الخنافس مع الخروج إلى وعاء البذور لمنع الخنافس من الهروب. الآن ، انفخ برفق فوق وعاء البذور لإزالة الخارج وجزيئات الزهرة من سطح الخنافس. اضغط على وعاء البذور للاستقرار.

المحتويات. انتظر حتى يخرج البالغون الأكثر قدرة على الحركة من الكومة وقم بإزالتهم لفصل زاوية الpupi ، والمقلاة لأسفل قليلا. اطرق برفق للف وإزالة الpupi ، مع ترك اليرقات فقط على صينية البذور.

الآن ضع اليرقات المعزولة في طبق بتري نظيف. حدد مرحلة اليرقات المطلوبة للحقن تحت المجهر ، واحتفظ بها في طبق بتري حتى التصريح. امزج المراحل المتبقية من الخنافس وضعها مرة أخرى في زجاجة ثقافة.

قم بتوصيل إبرة زجاجية مسحوبة بمجهر زجاجي. انزلق تحت مجهر تشريح. حدد مكان ثني الحافة.

أمسك المنطقة قليلا باتجاه جانب الحافة ولفها للكسر للحصول على الاختراق الأمثل لبشرة اليرقات ، وحدد إبرة بفتحة بزاوية يبلغ قطرها حوالي 0.05 ملم. الآن قم بفك طرف حامل الإبرة. ضع الطرف الخلفي للإبرة في طرف الحامل والحشية المطاطية أسفل طرف الحامل.

ثم أدخل الجزء الخلفي من الإبرة في الحامل ، مع التأكد من إدخال الحشية المطاطية في الفتحة. اربط الطرف مرة أخرى على الحامل. الآن ضع حامل الإبرة المجمع على مناور الإبرة.

اضبط الموضع بحيث يكون طرف الإبرة في منتصف مجال الرؤية المجهري. تحضير محلول الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل قبل الحقن مباشرة. قص طرف ماصة سعة 20 ميكرولتر يمكن التخلص منها.

الآن ماصة 10 ميكرولترات من المحلول في طرف الماصة المشذبة. قم بإزالة طرف الماصة بعناية من الماصة مع الحفاظ على السائل عند طرفه عن طريق توفير الضغط الخلفي. ضع طرف الماصة مع محلول الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل على مرحلة المجهر.

عند النظر من خلال المجهر ، حرك الطرف المحمل ببطء نحو الإبرة حتى يكون طرف الإبرة داخل طرف الماصة المحمل مباشرة وفي المحلول. ثم اسحب برفق مكبس حقنة الحقن لسحب المحلول ببطء إلى الإبرة دون زيادة التحميل على الإبرة. عندما تقترب نهاية محلول DS RNA من طرف الإبرة ، قم بإبطاء معدل السحب وتوقف عن تحميل المحلول قبل أن يصل طرف الإبرة إلى الهواء لتجنب الامتصاص السريع في حامل الإبرة.

افتح قضيب الإيقاف لإزالة الضغط من حقنة الحقن وحامل الإبرة. ثم حرك طرف الماصة بعيدا عن طرف الإبرة. الآن ارفع الإبرة إلى أعلى المسرح وقم بإزالة طرف الماصة المفرغ من مرحلة المجهر.

ضع اليرقات في سلة التفويض الإلكترونية ثم ضع السلة في زجاجة الأثير وأغلق الغطاء. بعد ثلاث دقائق ، افحص اليرقات بحثا عن الحركة. إذا كانت لا تزال تتحرك ، ضعها مرة أخرى في زجاجة الأثير لمدة 30 ثانية أخرى.

انقل اليرقات المعتمدة من E من السلة إلى الحافة غير اللاصقة لشريحة زجاجية لزجة. انقل اليرقات بالتتابع إلى الشريحة. ضع كل واحد بشكل جانبي.

اضغط برفق على الجسم من الرأس إلى الذيل باستخدام ملقط وقم بتمديده قليلا لتأمين اليرقات على الشريحة. الآن ضع الشريحة المعدة على مرحلة المجهر. أدخل الإبرة المحملة بالحمض النووي الريبي المزدوج برفق في الجانب الظهري من اليرقات ، باستخدام المرحلة لنقل اليرقات إلى الإبرة.

ثم اسحب الإبرة للخلف قليلا للحصول على DS RNA. لدخول تجويف جسم اليرقة ، ادفع برفق على حقنة الحقن حتى تتحول اليرقات إلى اللون الأخضر وتبدو مشدودة وممتلئة. بعد ذلك ، قم بإزالة الإبرة من اليرقات مع سحب حقنة الحقن قليلا.

حقن كل اليرقات على الشريحة. تأكد من إزالة اليرقات التي لم يتم حقنها بنجاح. ضع اليرقات المحقونة جانبا حتى تتعافى جميع اليرقات من التصريح E.

الآن ارفع اليرقات برفق من الرأس إلى الذيل ، وانقلها إلى طبق بتري نظيف واتركها لمدة 10 دقائق على الأقل للسماح لجرح الحقن بالتجلط. ثم استزراع اليرقات المحقونة عند 30 درجة مئوية مع 70٪ رطوبة. راقب اليرقات بحثا عن الأنماط الظاهرية للحمض النووي الريبي بانتظام.

توضح هذه الأمثلة مستويات نجاح متفاوتة للحقن بمحلول الحمض النووي الريبي الأخضر المزدوج الذي تقطعت به السبل في يرقة الطور الأخير بإبرة حقن بحجم مناسب. يخترق طرف الإبرة بشرة اليرقة بأقل قدر من المقاومة ، ويتدفق محلول DS RNA الأخضر إلى اليرقات دون أي تسرب. في سلالة PU 11 ، يمكن أن يكون بروتين الفلورسنت الأصفر المحسن بمثابة تحكم إيجابي جيد لتجارب حقن الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة.

عندما يتم حقن EYFP DS RNA في المرحلة اليرقية الأخيرة ، يمكن ملاحظة انخفاض كبير في إشارة EYFP في الجناح البدائي المستقبلي في وقت مبكر بعد يوم واحد من الحقن. يمكن ملاحظة ضربة قاضية لتعبير EYFP بشكل عام بعد يومين من الحقن ، وإذا كان تركيز DS RNA مرتفعا بدرجة كافية ، فسيستمر خلال مرحلة التلميذ وطوال حياة الخنفساء. نظرا لأن EYFP هو تسلسل جيني غير داخلي ، يمكن أيضا استخدام هذا الجين كعنصر تحكم سلبي لا ينبغي أن يسبب اضطرابات مورفولوجية أو فسيولوجية.

في هذه التجربة ، تم حقن الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل لأثر ، وهو جين جناح حرج في يرقات المرحلة قبل الأخيرة. لاحظ أنه يمكن ملاحظة الفقدان الكامل لهياكل الجناح في مرحلة التلميذ. يفتقر البالغ الناتج أيضا إلى هياكل الأجنحة.

بمجرد إتقان ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل التهجين الكمي في الوقت الفعلي PCR في الموقع أو الكيمياء المناعية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الجينات التي ينظمها الجين المستهدف بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لإجراء تحليل فقدان الوظيفة ومراحل ما بعد الجنين في traum casten دون استخدام تقنيات علم الوراثة المعقدة.

كما أن الطبيعة البسيطة لهذه الطريقة تجعلها قابلة للتطبيق بشكل كبير في بيئة التدريس. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اختيار المرحلة المناسبة من الحب للحقن ، وكيفية صنع إبرة الحقن ، وإجراء الحقن المسموح به للحمض النووي الريبي المزدوج بنجاح. سيسمح لك هذا البروتوكول بتقييم وظيفة الجين من خلال مستوى RNI في Trium.