تصور الإيماس غير التحللي من الأدعومية المستخفية من الضامة الرقمية الخفيفة عن طريق الميكروسكوب

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور إفراز الخلايا غير الظهارية للمكورات المستخفية الحديثة من البلاعم العصبية لنخاع العظم الأولية. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء وإصابة البلاعم العصبية المنشطة أولا بالخلايا الفطرية للسماح بالبلعمة واستيعاب الزيومين. الخطوة الثانية هي إزالة الخلايا الفطرية خارج الخلية لضمان طبقة أحادية واضحة من البلاعم المصابة وغير المصابة.

بعد ذلك ، يتم تحضين البلاعم في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها بثاني أكسيد الكربون وتسجيلها لمدة 24 ساعة من أجل التقاط حالات إفراز الخلايا غير الحجرية والتفاعلات الأخرى. الخطوة الأخيرة هي إنشاء فيلم عن طريق ضغط جميع الإطارات التي تم إنشاؤها في فترة 24 ساعة. في النهاية ، يتم استخدام تصور البلاعم باستخدام المجهر الضوئي الرقمي لمراقبة مجموعة متنوعة من أنواع إفراز الخلايا غير الحجرية التي تتعرض لها البلاعم طوال فترة العدوى لمدة 24 ساعة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تفاعل مسببات الأمراض المضيفة ، مثل توقيت الأحداث الخلوية وتقديرها الكمي في اليوم السابق للتجربة ، حدد مستعمرة واحدة من كبار العمال التي نمت على صفيحة سبارو أجار وقم بتلقيحها. 10 مل من مرق سبارو. اسمح للثقافة بالنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، وتهتز بسرعة 250 دورة في الدقيقة بعد القتل الرحيم للفئران كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

عقم الجسم كله بالكحول الإيثيلي بنسبة 70٪. قم بإزالة كل من عظم الفخذ والساق وضع العظام في الثنائي المعقم أو وسط النسر المعدل أو DMEM. ثم قم بإزالة الأنسجة والعضلات الزائدة باستخدام مناديل رقيقة حتى تصبح العظام نظيفة تماما.

ضع العظام السليمة فقط في طبق بتري يحتوي على 70٪ كحول إيثيلي واحتضنه لمدة ثلاث دقائق لقتل الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة به. انزع العظام وضعها في طبق بتري مع DMEM معقم. بعد ذلك ، قطع بعناية نهايات العظام.

امسك العظم فوق أنبوب مخروطي MT 50 مليلتر يوضع على الجليد ، واستخدم إبرة قياس 25 لغسل 10 ملليلتر من DMEM البارد بعناية من خلال كل عظم. ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية المجمعة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 650 مرة G.أثناء هذا الطرد المركزي ، قم بإعداد وتصفية وسائط تغذية البلاعم نخاع العظم كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بتعليق اللوحة الناتجة باستخدام 10 مل من وسائط التغذية.

مرر معلق الخلية عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر لتعطيل كتل الخلايا وإزالة الحطام الكبير. ثم قم بتقطيع مليلتر واحد من تعليق خلية الإجهاد إلى 10 ملليلتر من وسائط التغذية ، وأطباق بتري المحددة لاستخدام زراعة الأنسجة. اسمح للخلايا بالالتصاق عند 37 درجة مئوية مع 10٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة سبعة أيام.

تغيير وسائط التغذية كما هو موضح في بروتوكول النص في اليوم السابق للتجربة. فصل البلاعم عن اللوحة عن طريق إزالة وسائط التغذية وإضافة خمسة ملليلتر من كاشف تجريد الخلية اللطيف إلى اللوحة بعد حضانة الخلايا لمدة خمس إلى 10 دقائق. عند 37 درجة مئوية ، قم بإزالة الضامة باستخدام ماصة لطيفة.

تكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 650 مرات G لمدة 10 دقائق قبل ثني الحبيبات في مليلتر واحد من وسائط التغذية. باستخدام تخفيف من واحد إلى 20 ، احسب تركيز البلاعم عن طريق سحب 10 ميكرولترات من تعليق الخلية في مقياس الخلوي الدموي باستخدام زجاج 14 ملم ذو قاع الزجاج. تضع أطباق بتري تركيزا واحدا في 10 إلى البلاعم الخامسة مباشرة في البئر الداخلي ، والذي يحتوي على 200 ميكرولتر كحد أقصى.

احرص على عدم تجاوز هذا الحجم. اسمح للخلايا بالالتصاق بطبق بتري الزجاجي عن طريق وضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم أضف ملليلترا إلى ملليلترين من وسائط التغذية المكملة بعديدات السكاريد الدهنية بمعدل واحد ملليغرام لكل مليلتر وإنترفيرون جاما.

عند 500 وحدة لكل ملليلتر ، اسمح للخلايا بالتحتضن طوال الليل في يوم التجربة. قم بإزالة مليلتر واحد من ثقافة الخلايا G الملقحة طوال الليل وقم بتجميع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق من 420 مرة G.To إزالة الوسائط ومنتجات المكورات المشفرة خارج الخلية ، وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS متبوعا بالطرد المركزي كما كان من قبل. بعد إعادة التشكيل ، قم بتعليق حبيبات خلية الخميرة في مليلتر واحد من PBS المعقم وعمل ماصة تخفيف من واحد إلى 100 ميكرولتر من التخفيف في مقياس الخلوي الدموي وعد الخلايا.

احسب تركيز خلايا الخميرة اللازمة لتعدد العدوى من واحد إلى خمسة. أضف الحجم المحسوب لتعليق الخلايا المشفرة إلى مليلتر واحد من وسائط التغذية بالجسم المضاد أحادي النسيلة ، 18 ب سبعة بتركيز 10 ميكروغرام لكل مليلتر. احتضان تعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بإزالة وسائط التغذية من طبق بتري الزجاجي واغسل البلاعم مرة واحدة باستخدام PBS المعقم. ثم أضف 100 ميكرولتر من السن المرجعي مباشرة إلى البئر ، متبوعا بحضانة الخميرة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 10٪ جانب ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة المشتركة التي تم فحصها بواسطة المجهر أن البلاعم قد استوعبت c eForms ليتم اعتبارها خلايا المكورات المشفرة الداخلية يجب رؤيتها بوضوح داخل حدود البلاعم كما هو موضح في رأس السهم الكبير.

يشير رأس السهم الأصغر إلى بلاعم غير مصابة بدون خلايا فطرية. اغسل طبق بتري ثلاث مرات باستخدام PBS معقم لإزالة أي وجميع النيوفورمان خارج الخلية. ثم أضف ملليلترا إلى ملليلترين من وسائط التغذية بدون الجسم المضاد أحادي النسيلة لإجراء هذه التجارب.

مطلوب مجهر مجهز بغرفة حضانة متصلة تتضمن توصيل ثاني أكسيد الكربون ووحدة تسخين قبل التجربة. قم بتسخين غرفة الحضانة لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية. تأكد من أن وحدة ثاني أكسيد الكربون تقرأ 5٪ في بداية التجربة.

ضع طبق بتري ذو القاع الزجاجي على غطاء منصة المجهر بإضاءة ثاني أكسيد الكربون وأغلق جميع الأبواب لضمان عدم تسرب الحرارة باستخدام هدف 10 × مع المجهر في تباين الطور ، وركز على مجال واضح من البلاعم المصابة ، قم بإعداد برنامج المجهر لالتقاط صورة كل أربع دقائق لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، ستكون التجربة قد اكتملت وسيتم جمع ما مجموعه 361 صورة. قم بتصدير هذه الصور بتنسيق JPEG بضغط 5٪.

باستخدام برنامج الصورة J ، اعرض الصور كحزمة مرئية بمعدل خمسة إطارات في الثانية. يظهر الإطار الأولي للفيلم العديد من البلاعم في جميع أنحاء الحقل مع بعضها غير مصاب وبعضها يحتوي على كميات متفاوتة من خلايا المكورات المشفرة. مع تقدم الفيلم ، تكون الخلايا كلها mo ويمكن رؤيتها وهي تتحرك في الحقل في هذا الفيلم ، ومن الواضح أن خلايا المكورات المشفرة تقع داخل حدود البلاعم المصابة.

تصبح البلاعم مضطربة ويمكن رؤية خلية الخميرة ، ولكن داخل منطقة FGA ، يتم بعد ذلك محو خلايا المكورات المشفرة بسرعة في البيئة المحيطة. تخضع البلاعم المصابة الثانية لإفراز الخلايا غير الحجرية ويتم إطلاق المزيد من خلايا الخميرة في الفضاء خارج الخلية. تظل الخلايا المضيفة قابلة للحياة بعد إفراز المكورات المشفرة كما يتضح من قدرتها على الاستمرار في الحركة.

في بعض الأحيان ، تتفاعل البلاعم بطريقة تسهل نقل خلايا المكورات المشفرة بين الخلايا المضيفة. لا تتعرض خلايا الخميرة للبيئة خارج الخلية وتظل الخلايا المضيفة قابلة للحياة. في هذا الفيلم ، تقوم اثنتان من البلاعم المصابة بإنشاء جسور خلية إلى خلية في مناسبتين منفصلتين لنقل خلايا المكورات المشفرة من بلاعم إلى أخرى.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الفحص المجهري الضوئي الرقمي لتصور البلاعم التي تخضع لإفراز الخلايا غير المحلل ، وتفاعلات مسببات الأمراض المضيفة الأخرى.