ربط ذات كفاءة عالية من الحمض النووي الريبي الجزيئات الصغيرة لالرنا الميكروي الكميات من قبل التسلسل الإنتاجية العالية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد microRNAs بشكل غير متحيز لتسلسل عالي الإنتاجية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير أو شراء قليل النوكليوتيدات الحمض النووي المختصة بالربط بالأطراف الرئيسية الثلاثة للحمض النووي الريبي الصغير. الخطوة الثانية هي ربط قليل النوكليوتيدات الأولية الثلاثة للحمض النووي بالطرف الثلاثة الأولي للحمض النووي الريبي الصغير.

بعد ذلك ، يتم تنقية منتج الربط بالهلام ويتم ربط رابط قليل النوكليوتيدات الحمض النووي الريبي الخمسة الرئيسي بالطرف الخمسة من الحمض النووي الريبي الصغير. الخطوة الأخيرة هي تحويل الجزيئات الهجينة إلى CDNA ثم تضخيم CDNA عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل. في النهاية ، يتم استخدام استنساخ الحمض النووي الريبي الصغير وتسلسل الإنتاجية العالي لإظهار ملف تعريف النسخ العريض للميكرو RNAs بطريقة كمية بدقة النوكليوتيدات الفردية.

الميزة الرئيسية لتقنيتنا على التقنيات الحالية مثل لطخة qPCR للتسلسل الدقيق ، هي أن تقنيتنا أكثر انعكاسا للمستوى الفعلي للأشعة الدقيقة على نطاق مختبر واسع للنسخ بدقة نوكليوتيدات واحدة. في حين أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لبيولوجيا الحمض النووي الريبي الصغير ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على تقنيات التسلسل الأخرى عالية الإنتاجية مثل مشبك HC و RNA-Seq. تم تصميم قليل النوكليوتيدات الحمض النووي لهذا الإجراء لثلاثة تفاعلات ربط أولية ويجب أن تحتوي على مجموعة فوسفات بخمسة رئيسية ، وثنائي النوكليوتيدات العشوائية في الطرف الخمسة الأولي وسيتوزين ثلاثي الرئيسيين يخفف قليل النوكليوتيدات الحمض النووي إلى 100 ميكرومولار في الماء الخالي من النوكلياز.

قم بتجميع تفاعل التهوية من خلال الجمع بين هذه الكواشف 200 مول بيكو من قليل النوكليوتيد الرابط الرئيسي الثلاثة ، وأربعة ميكرولترات من خمسة عازلة تهوية رئيسية للحمض النووي ، وأربعة ميكرولترات من TP ، وأربعة ميكرولتر من M-T-H-R-N-A ، ليجاز والماء الخالي من النوكلياز إلى حجم نهائي يبلغ 40 ميكرولترا. احتضان التفاعل عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بإنهاء التفاعل عن طريق التسخين إلى 85 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

قم بترسيب رابط TED عن طريق إضافة 2.5 حجم من 100٪ من الإيثانول وثلث حجم 10 أسيتات الأمونيوم المولارية. لإزالة بقايا TP ولمنع الارتباطات غير المتوقعة في التفاعلات المستقبلية ، امزج محلول الكحول والملح وقليل النوكليوتيدات إلى التجانس عن طريق الدوران بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي دقيق عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. اغسل الحبيبات في 70٪ من الإيثانول بالهواء الجاف وأعد تعليق الحبيبات في الحجم المناسب من الماء الخالي من النوكلياز لإنتاج 50 إلى 100 ميكرومولار من قليل النوكليوتيد جيد التهوية.

تأكد من تهوية قليل النوكليوتيد عن طريق الرحلان الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد 18٪. قم بتشغيل الجل مسبقا لمدة 30 دقيقة عند 24 فولت سنتيمتر من عرض الجل مع تشغيل مخزن مؤقت XTBE واحد في درجة حرارة الغرفة. بمجرد انتهاء 30 دقيقة ، اغسل الآبار بعازلة قيد التشغيل.

تصميم قليل النوكليوتيدات الحمض النووي لهذا الإجراء لثلاثة تفاعلات ربط أولية ويجب أن تحتوي على مجموعة فوسفات خماسية ، وثنائي النوكليوتيدات العشوائية في الطرف الخمسة الأولي وأوكسيتوسين ثلاثي الرئيسيين. خفف قليل النوكليوتيدات الحمض النووي إلى 100 ميكرومولار في ماء خال من النوكلياز. قم بتشغيل الجل بجهد 24 فولت لكل سنتيمتر حتى يصبح اللون الأزرق الفينول برومو ثلاثة أرباع الطريق إلى أسفل عمود الجل.

قم بتلطيخ الجل بمحلول واحد من الذهب السيبراني في XTBE واحد وتخيله على صندوق ترانسوينابير للأشعة فوق البنفسجية. يجب أن يكون هناك تحول نوكليوتيدات واحد في حجم قليل النوكليوتيد DNA الذي كان خاضعا للتهوية بواسطة M-T-H-R-N-A ligase لتفاعل الربط الأولي الثلاثة. قم بتجميع المكونات التالية على الجليد بهذا الترتيب.

ميكرولتر واحد من 50٪ PEG 8 ، 000 0.5 ميكرولتر من 10 مخزن مؤقت XRNA ligase. ميكرولتر واحد من رابط ثلاثي التهوية ، 0.5 ميكرولتر من مثبط الحمض النووي الريبي 0.5 إلى ثمانية ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي 0.5 ميكرولتر من T أربعة RNA Ligase اثنين والماء الخالي من النوكلياز إلى حجم نهائي يبلغ خمسة ميكرولترات. امزج التفاعل عن طريق سحب العينة بمجرد خلطه جيدا.

ضع التفاعل في جهاز تدوير حراري بغطاء ساخن. اضبط الكتلة على 16 درجة مئوية واحتضنها لمدة أربع ساعات. لاحظ أنه يمكن توسيع نطاق التفاعل إلى الحجم النهائي البالغ 20 ميكرولتر دون أي خسارة في كفاءة الربط.

بعد الربط الأولي الثلاثة ، امزج التفاعل بحجم متساو من حرارة عازلة تحميل XRNA إلى 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق واتركها تبرد على الجليد. الجل التالي. قم بتنقية العينة على جل بولي أكريلاميد 15٪.

قم بتشغيل الجل مسبقا عند 24 فولت من عرض الجل لمدة 30 دقيقة على الأقل. قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة وغسل الآبار باستخدام عازلة قيد التشغيل. قم بتحميل العينة وتشغيل الجل بنفس جهد التشغيل المسبق حتى ينفجر فينول البرومو للتو من الجل.

سوف ينتقل المنتج المطلوب بالقرب من سماوي الزيلين عند اكتمال الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد. ضع الجل في صينية نظيفة مع مخزن مؤقت واحد × وواحد × ذهب سايبر وصخور لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة الجل من طبق التلوين وتخيله على صندوق ترانسفير للأشعة فوق البنفسجية مغطى بغلاف بلاستيكي نظيف.

يجب أن يكون طول منتج الربط حوالي 45 نيوكليوتيد. نظرا لأن منتج الربط هذا عادة ما يكون غير مرئي ، فمن المهم تضمين عينة من الحمض النووي الريبي الاصطناعي للتحكم الإيجابي في الممر المجاور باستخدام شفرة حلاقة نظيفة ، وهي المنطقة التي تحتوي على منتج الربط. مسترشدا بمواضع عينة الحمض النووي الريبي الاصطناعي ومعايير الحجم.

ضع جزء هلام المكوس في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 ملليلتر. اخترق الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الصغير 0.5 ملليلتر بإبرة قياس 30 وضع أنبوب الثقب في جهاز طرد مركزي أنبوب طرد مركزي صغير نظيف ونظيف 1.5 مليلتر لمدة خمس دقائق في حوالي 15 ، 000 مرة. G. تأكد بصريا من أن شريحة الجل بأكملها قد تحركت عبر الفتحة الموجودة في الأنبوب الداخلي.

إذا لزم الأمر، استخدم طرف ماصة نظيف لدفع بعض شظايا الهلام بالقرب من الفتحة. تخلص من الأنبوب الفارغ 0.5 مليلتر وأضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعمود الملح العالي إلى ملاط الأكريلاميد. هز الأنبوب عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها في اليوم التالي.

انقل الملاط إلى عمود دوران أسيتات السليلوز 0.22 ميكرون باستخدام جهاز طرد مركزي ذو طرف ماصة عريض التجويف لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة عند حوالي 15،000 مرة. G لجمع كل السوائل بعيدا عن مصفوفة هلام الأكريلاميد. انقل السائل إلى أنبوب نظيف منخفض الاحتفاظ بسعة 1.5 ملليلتر يحتوي على ميكرولتر واحد من محلول الجليكوجين 20 ملليغرام لكل مليلتر.

أضف حجما متساويا من الأيزوبروبانول وحجما واحدا عشر من أسيتات الصوديوم واخلط المحلول عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. يرسم في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 20 دقيقة. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

لتكبيل الحمض النووي ، قم بإزالة snat واغسله في هواء الإيثانول بنسبة 70٪. جفف الحبيبات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وانتقل مباشرة إلى خطوة الربط الخمسة الرئيسية. لبدء هذا الإجراء ، أضف المكونات التالية إلى الحمض النووي الذي تم تكويبه مسبقا ، ولترين ميكرولترين من PEG 8 ، 000 0.5 ميكرولتر من محلول RNA Ligase ، و 0.5 ميكرولتر من TP 0.5 ميكرولتر من الرابط ، وقليل النوكليوتيد RNA والماء إلى حجم نهائي يبلغ أربعة ميكرولترات.

امزج هذه العينة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل بشكل متكرر لمدة تصل إلى خمس دقائق للتأكد من إعادة إذابة الحبيبات تماما. بمجرد أن تصبح الحبيبات في المحلول ، انقل المحتويات إلى أنبوب PCR نظيف يحتوي على ميكرولتر واحد من خليط واحد لواحد من مثبطات الحمض النووي الريبي و T four RNA ligase واحد مختلط عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. احتضان التفاعل في دورة حرارية عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

عند اكتمال التفاعل ، انتقل على الفور إلى توليف CD NA كما هو موضح في نص البروتوكول بعد ربط الرابط بالأطراف الرئيسية الثلاثة للحمض النووي الريبي وتحليل صفحة التفاعلات. تظهر نطاقات الوزن الجزيئي العالية الحادة في منطقة 100 إلى 300 نيوكليوتيدات من الهلام ، مما يشير إلى أن إجمالي عينة الحمض النووي الريبي المستخدمة ذات جودة عالية. تشير الإشارة الساطعة للغاية في منطقة 25 نيوكليوتيدات من الجل إلى الحمض النووي الريبي الاصطناعي الزائد غير المرتبط بثلاثة رابط رئيسي إلى ربط يتم إجراؤه باستخدام خمسة بيكومولات من الحمض النووي الريبي الصغير الاصطناعي وثلاثة رابط رئيسي ، والذي تم تنقية الجل.

يظهر هنا مخطط شعاعي تلقائي لثلاثة تفاعلات ربط أولية يتم إجراؤها باستخدام P 32 5 أولي ويسمى الحمض النووي الريبي الصغير الاصطناعي. يشار إلى عدد الساعات التي سمح فيها للتفاعل بالمضي قدما في الأعلى ، وتشير الأرقام الموجودة في الأسفل إلى المبالغ المربوطة كنسبة مئوية من مجموع غير المرتبطين والمرتبطين. يتكون هذا الرسم الشعاعي التلقائي من خمسة تفاعلات ربط أولية يتم إجراؤها باستخدام P 32 5 نهاية أولية تسمى الحمض النووي الريبي الصغير الاصطناعي بثلاثة أنواع هجينة من الرابط الرئيسي.

تشير الأرقام الموجودة في الأسفل إلى المبالغ المربوطة كنسبة مئوية من مجموع غير المرتبط والمرتبط ، وتكشف عن أهمية استخدام تركيز عال من PEG 8 ، 000 R-N-A-D-N-A. يتم إنشاء المكتبات المتوافقة مع التسلسل عالي الإنتاجية لاحقا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتم تحديد العدد المناسب لدورات تفاعل البوليميراز المتسلسل تجريبيا.

في هذا المثال ، حجم منتج الحمض النووي المتوقع هو 146 زوجا أساسيا بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح في يومين فقط. أثناء تنفيذ هذه التقنية ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على جميع الأطراف والأنابيب خالية من الحمض النووي الريبي.