بروتوكول قابل للتخصيص "الجمعية سلسلة" جرنة الاستنساخ (ستأجر)

هنا، فإننا نقدم سلسلة الجمعية جرنا الاستنساخ (ستأجر)، أسلوب متعدد ناقلات جرنا بسهولة لنهج كريسبر/Cas9. ستأجر يجعل الإرسال المتعدد جرنة بسيطة وفعالة وقابلة للتخصيص.

وقد زاد نظام كريسبر-Cas9 البكتيرية بشكل كبير من الخيارات التجريبية لعلماء الحياة. ومع ذلك، تعتمد عدة نهج CRISPR على التسليم المتزامن لـ RNAs الدليلي المتعدد في الخلايا الفردية. سلسلة تجميع جيرنا استنساخ يسمح لتوليد بسيطة وسريعة من ناقلات التعبير GRNA متعددة في خطوة واحدة استنساخ واحد.

ولكن STAgR ليست بسيطة فقط ، بل هي أيضا فعالة ورخيصة وسهلة لتخصيص. للبدء، إضافة تسلسل N20 رنا إلى التمهيديات التضخيم إلى الأمام لسلسلة الحمض النووي STAgR كما يتدلى. أضف تسلسلات GRNA إحساس خمسة رئيس إلى التمهيدي إلى الأمام، التمهيدي سقالة إلى الأمام، للسقالة التقليدية، أو إلى التمهيدي لسام إلى الأمام للسقالة التي تحتوي على MS2.

بعد ذلك، إضافة تسلسل N20 دنا الإضافة العكسية إلى تسلسل التمهيدي العكسي، واختيار التمهيديات RP، اعتمادا على المروجين والسلاسل محددة المستخدمة. للبدء في توليد شظايا الاستنساخ الفردية لجمعية جيبسون ، ونقل 10 ميكرولترات من العازلة عالية الدقة إلى أنبوب. إضافة ميكرولتر واحد من 10 dNTPs milimolar و 0.25 ميكرولترات من كل من 100 التمهيديات ابر من 100 micromolar.

إضافة 10 نانوغرام من سلسلة قالب الحمض النووي، أو ناقلات، و 1.5 ميكرولترات من DMSO. إضافة ما يكفي من الماء لتحقيق حجم النهائي إلى 49.5 ميكرولتر، ثم إضافة 0.5 ميكرولترات من البوليميراز HF. احتضان ردود الفعل على thermocycler ، كما هو مبين في بروتوكول النص.

بعد هذا, اتخاذ 5.5 أليكوت ميكرولتر من تفاعل PCR. إضافة صبغة التحميل إلى جميع aliquots، وتحميله على هلام agarose 1٪. قم بتحميل سلم الحمض النووي المناسب للتحجيم، وتشغيل الجل في عازلة مناسبة تعمل بالهلام بسرعة 120 فولت لمدة 30 دقيقة.

في حين أن الجل قيد التشغيل، إضافة خمسة microliters من المخزن المؤقت المقدمة مع إنزيم تقييد، و 0.5 microliters DpnI إلى 44.5 microliters المتبقية من رد فعل ناقل PCR لإزالة قالب البلازميد المتبقية المستخدمة خلال PCR. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. تحقق للتأكد من أن amplicons هي الحجم الصحيح.

لبدء تنقية الحمض النووي، إضافة 1.8 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي لكل ميكرولتر واحد من المنتج PCR، ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. باستخدام المغناطيس، وفصل الخرز في شظايا الحمض النووي من السائل المتبقي.

شطف بيليه مع 70٪ الإيثانول دون resuspending تماما، لغسل الخرز. كرر هذا غسل مرة واحدة إضافية. باستخدام ماصة، وإزالة كل من الإيثانول والسماح للهواء بيليه الجافة.

ثم إضافة 15 إلى 20 ميكرولتر من الماء، وماصة صعودا وهبوطا لخلط وحل بيليه. استخدام المغناطيس لفصل الخرز من السائل. نقل مُنَاَعِرِح واضح إلى أنبوب جديد.

بعد ذلك، استخدم مقياس طيفي لتحديد تركيزات الحمض النووي. أولاً، إعداد 5x تفاعل حراري المخزن المؤقت كما هو مفصل في بروتوكول النص. لMicro جيبسون ماجستير ميكس ، والجمع بين 320 ميكرولترات من 5x العازلة التفاعل الحراري مع 697 ميكرولترات من الماء.

إضافة 3 ميكرولترات من T5 exonuclease، 20 ميكرولترات من بوليميراز الحمض النووي، و 160 mciroliters من طق الحمض النووي ligase. نقل 7.5 ميكرولترات من الجمعية ماجستير ميكس إلى أنبوب جديد. ثم إضافة 2.5 ميكرولترات من إدراج في ناقلات، كما هو مبين في بروتوكول النص.

احتضان العينات في 50 درجة مئوية لمدة 45 إلى 60 دقيقة. بعد ذلك، تخزين العينات على الجليد، أو في 20 درجة مئوية، للتحول اللاحقة. عندما تكون على استعداد لتحويل البكتيريا، ذوبان كيميائيا المختصة TOP10 البكتيريا القولونية E.Coli على الجليد.

بعد ذلك ، أضف خمسة ميكروليتر من مزيج جيبسون إلى 50 ميكرولترات من البكتيريا المختصة ، واخلط بلطف الجزء السفلي من الأنبوب. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. وضع أنبوب في 42 درجة مئوية حمام الماء أو كتلة الحرارة لمدة 45 ثانية لتسخين البكتيريا.

ثم، ضع الأنابيب مرة أخرى على الجليد. إضافة 250 ميكرولترات من SOC المتوسطة إلى البكتيريا، والسماح لهم التعافي في 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز لمدة 30 إلى 45 دقيقة. بعد أن تعافى البكتيريا, لوحة لهم على 1.5٪ LB لوحات أجار التي تحتوي على 100 ميكروغرام لكل المليلتر أمبيسيلين.

احتضان لوحات في 37 درجة مئوية خلال الليل. للبدء، إعداد ما لا يقل عن مجموعتين من 200 ميكرولتر أنابيب التفاعل PCR لكل بناء. ملء واحدة من مجموعات من أنابيب رد فعل مع 100 ميكرولترات LB المتوسطة, تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين.

باستخدام طرف ماصة معقمة، خدش قبالة المواد البيولوجية من مستعمرة بكتيرية واحدة، ونشرها في الجزء السفلي من أنبوب 200 دقيقة تفاعل PCR. نقل على الفور تلميح ماصة إلى أنبوب رد فعل المقابلة الثانية التي تحتوي على متوسطة LB. دوامة غيض حولها للتأكد من أن يتم نقل بعض البكتيريا إلى وسائل الإعلام LB.

احتضان في 37 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. ثم، إعداد 10 ميكرولترات من PCR ماجستير ميكس لكل رد فعل أنبوب، كما هو مبين في بروتوكول النص. إضافة 10 ميكرولترات من المزيج الرئيسي PCR إلى أنابيب التفاعل PCR المسمى، دون وسائل الإعلام LB.

باستخدام دراجة الحرارة، احتضان ردود الفعل كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد هذا، إضافة صبغة التحميل إلى شظايا تضخيم، وتحميلها على هلام agarose 1٪. قم بتحميل سلم الحمض النووي المناسب للتحجيم، وتشغيل الجل في عازلة مناسبة تعمل بالهلام بسرعة 120 فولت لمدة 30 دقيقة.

حساب الحجم النظري لل amplicon عن طريق إضافة ما يصل الأحجام الفردية من المروجين المستخدمة، السقالات GRNA، وعدد من تسلسل N20. من نتائج مستعمرة PCR، وتحديد المستنسخات البكتيرية، استنادا إلى حجم الفرقة الصحيح، وما إذا كانت من المرجح أن تؤوي ناقلات الصحيح. باستخدام ثقافة 100 ميكرولتر المقابلة، تلقيح 2.5 ملليلتر بين عشية وضحاها LB الثقافة التي تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسيلين.

احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. ثم، استخدام التجارية plasmid مصغرة عدة لاستخراج الحمض النووي البلازميد، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. في هذا الإجراء، يتم استخدام استنساخ grna تجميع سلسلة بسرعة لإنشاء بلازميدات التعبير GRNA.

وينظر إلى نتيجة نموذجية من PCRs المستخدمة للحصول على القطع STAgR هنا. وتمثل الـ(أمبيركونس) الستة قطع حمض نووي خطي، تحتوي كل منها على تسلسلات GRNA N20 الفردية على غاياتها. يتم توسيع العمود الفقري البلازميد مع تسلسل الاستهداف من GRNA1 و gRNA6، وبالتالي تمتلك التداخل المطلوب إلى اثنين PCRs أخرى لجمعية جيبسون.

بعد تنقية، يمكن تحقيق عائد الحمض النووي من ميكروغرام واحد على الأقل للمواتجهات وإدراج. بعد جمعية جيبسون، يؤدي التحول البكتيري إلى 100 إلى 700 مستعمرة بكتيرية. تحليل تمثيلي لـ 22 مستعمرة بكتيرية، عبر مستعمرة PCR بعد بروتوكول STAgR مع ستة أشرطة GRNA، يشير إلى أن سبعة استنساخ تظهر حجم أمبيركون المتوقع للتجميع الكامل.

ومن المرجح أن تكون المستنسخات الأخرى قد تلقت ناقلات STAgR، التي تحتوي على 1 إلى 5 أشرطة اسطوانات، في حين أن استنساخا واحدا فارغ تماما. مرة واحدة يتقن، يمكن أن يتم هذا الأسلوب في غضون ساعات قليلة. يؤدي بشكل صحيح، فإنه يسمح لتوليد العديد من ناقلات التعبير متعددة GRNA في أقل من أسبوع العمل.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تولي اهتماما لتعيين الصحيح والجمع بين التمهيديات فوق N20. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد حول كيفية إنشاء متعدد الخاص بك متعددة ناقلات التعبير RNA دليل.