أجهزة الورقية للعزل وتوصيف خارج الخلية الحويصلات

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الحويصلات خارج الخلية باستخدام منصة ورقية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التصفيح أولا باستخدام لوحين من البوليسترين مع السليلوز الدائري ، وقواطع الورق محاذاة على مجموعة من الثقوب المسجلة. الخطوة الثانية هي اقتران الجزيئات كيميائيا التي من شأنها أن تربط الحويصلات خارج الخلية بمنطقة الاختبار الورقية.

بعد ذلك ، يمكن سحب العينة البيولوجية مباشرة على منطقة اختبار الورق ، ويتم عزل الحويصلات خارج الخلية بعد خطوة الشطف. الخطوة الأخيرة هي توصيف الحويصلات خارج الخلية التقاطها باستخدام المجهر الإلكتروني أو إليزا أو تحليل النسخ. في النهاية ، يمكن تنقية وتركيز مجموعات فرعية من الحويصلات خارج الخلية من عينات مصل صغيرة تصل إلى 10 ميكرولتر.

لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل التعليم الفائق هي أنها تجميعها لطيفة للغاية وسهلة الأداء. سيكون إظهار الإجراء طالبا في الدراسات العليا ، هل يجب عليك. بدءا من ورقتين من البوليسترين ، قم بإنشاء مجموعة من القواطع الدائرية.

كل منها يعرض قطره أقل من خمسة ملليمترات إما مع ثقب يدوي أو كاد ، راسمة قاطعة آلية. بالإضافة إلى ذلك ، قم بقص سلسلة من الكروماتوغرافيا التي يبلغ قطرها خمسة ملليمترات ، وأقراص ورقية مع ثقب. ضع ورقة بوليسترين واحدة على المقعد وقم بتراكب قرص ورقي واحد فوق كل فتحة مقابلة.

الأقراص الورقية عن طريق تسجيل الورقة الثانية من البوليسترين وتراكبها. تحقق من المحاذاة الكلية قبل ربط الساندويتش في آلة تغليف حرارية. بعد ذلك ، ابدأ تعديلات السطح الكيميائي على الأقراص الورقية عن طريق إدخال الجهاز الرقائقي في غرفة البلازما.

قم بتنشيط سطح الورق لفترة وجيزة باستخدام بلازما الأكسجين عند تحرير فراغ الغرفة ، وانقل جهاز الورق على الفور إلى محلول السيلين واحتضانه لمدة 30 دقيقة. اضبط درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة الممرات الزائدة عن طريق شطف الجهاز بخمسة ملليلتر من 200 إيثانول برهان.

ثم احتضان الجهاز بمحلول رابط A-G-M-B-S لمدة 15 دقيقة. اضبط درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة جزيء الرابط الزائد بكميات وفيرة من شطف الإيثانول.

بعد ذلك ، احتضن الجهاز مع أفادون لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية وقم بإزالة أفادون غير المرتبط بغسل PBS بسعة خمسة ملليلتر. يمكن للجهاز بعد ذلك المضي قدما إما إلى خطوة ربط الجسم المضاد أو تخزينه عند أربع درجات مئوية لمدة أربعة أسابيع إذا لزم الأمر. عند ماصة توصيل عدن ، ضع 10 ميكرولترات من محلول المانع على مناطق قرص الورق المكشوف واحتضان الورق لمدة 10 دقائق.

في درجة حرارة الغرفة ، كرر إضافة 10 ميكرولتر من محلول الحجب وحضانة درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. مرتين أخريين لإكمال الوظيفة الحيوية لماصة الركيزة الورقية المكشوفة 10 ميكرولترات من جزيئات التقاط البيوتينيل على الأقراص واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحويصلات خارج الخلية ، يمكن أن تكون جزيئات الالتقاط المفضلة إما أجساما مضادة ل CD 63 أو xin خمسة. كرر عملية سحب العينات سعة 10 ميكرولتر وعمليات الحضانة لمدة 10 دقائق.

مرتين أخريين بعد التقاط مرفق الجزيء. اغسل الشقوق الزائدة عن طريق سحب العينات. 10 ميكرولتر من مخزن الغسيل المناسب على كل قرص ورقي.

احتضن الغسيل لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وكرر الغسيل 10 ميكرولتر وخطوات الحضانة لمدة دقيقة مرتين أخريين. الجهاز الورقي الذي يعمل بكامل طاقته جاهز الآن لعزل الحويصلات خارج الخلية عن المصل أو الخلط المائي لمعالجة المصل. اجمع 10 ملليلتر من الدم المحيطي في أنبوب فراغ واقلب الأنبوب برفق خمس مرات.

ضع الأنبوب في وضع رأسي وانتظر لمدة 30 دقيقة. اضبط درجة حرارة الغرفة ، وقم بالطرد المركزي لعينة الدم لمدة 15 دقيقة. اضبط درجة حرارة الغرفة.

انقل طبقة المصل العلوية الشفافة إلى أنبوب بلاستيكي نظيف وتخلص من المرحلة السفلية شبه الصلبة. قم بتنظيف المصل بسرعة طرد مركزي أعلى لمدة 30 دقيقة. اضبط درجة حرارة الغرفة.

انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وقم بإزالة الجسيمات الدقيقة عن طريق تمرير المادة الطافية عبر مرشح 0.8 ميكرومتر. يمكن استخدام المصل المصفى الناتج على الفور أو تخزينه عند سالب 80 درجة مئوية. إذا كان سيتم استخراج الحويصلات خارج الخلية من الفكاهة ، فقم بجمع الخلط المائي من المرضى مباشرة من خلال الإجراءات الغازية وتخزين العينات عند سالب 80 درجة مئوية.

حتى الاستخدام ، ليست هناك حاجة إلى خطوات ترشيح أو توضيح لعينات الخلط الزجاجي. لعزل الحويصلات خارج الخلية عن المصل أو الخلط المائي ، ضع الماصة خمسة ميكرولترات من العينة البيولوجية على كل قرص ركيزة ورقي وظيفي حيوي. احتضن البقعة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وكرر عملية سحب العينات بسعة خمسة ميكرولتر وعمليات الحضانة لمدة دقيقة واحدة.

مرتين أخريين بعد ربط التقارب، اشطف الحويصلات غير المرتبطة عن طريق سحب 10 ميكرولتر من مخزن الغسيل المناسب. احتضن المخزن المؤقت لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وكرر الغسيل 10 ميكرولتر والحضانة اللاحقة. الخطوة مرتين أخريين.

أصبحت الحويصلات خارج الخلية الملتقطة جاهزة الآن للمقايسات النهائية التالية لتثبيت الحويصلات الملتقطة على ماصة دعم الورق الوظيفية 10 ميكرولتر من 0.5 × مثبتة كارنوفسكي على كل قرص ورقي. دع تفاعل الربط المتقاطع يستمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق واشطف جميع الأقراص بكميات وفيرة من PBS لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بتجفيف ركائز الورق عن طريق تطبيق الغسالات التالية بالترتيب.

حضانة واحدة للإيثانول بنسبة 35٪ ، وحضانات إيثانول بنسبة 50٪ ، وحضانتان بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وحضانات 95٪ من الإيثانول ، وأربع حضانات إيثانول بنسبة 100٪. لكل غسلة فردية ، اترك محلول الإيثانول يحتضن أعلى أقراص الورق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. عندما يكون الجهاز الورقي جافا للعظام ، قم بتغطية العينات بطبقة 18 نانومتر من ذهب البلاديوم في رش معدني.

أدخل العينة في المجهر الإلكتروني الماسح وقم بإجراء الفحص المجهري عند خمسة كيلو فولت لمنع الشحن الزائد للعينة البيولوجية للكشف عن الحويصلات الملتقطة عن طريق المقايسات المناعية. ابدأ بإضافة خمسة ميكرولترات من الأجسام المضادة الأساسية المضادة للقرص المضغوط تسعة على كل قرص ورقي واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة جميع الأجسام المضادة غير المرتبطة عن طريق غسل الجهاز الورقي ب 30 مل من PBS بدرجة حرارة الغرفة عن طريق التحريك الميكانيكي.

بعد ذلك ، ضع الماصة خمسة ميكرولترات من فجل الحصان بيروكسيداز الجسم المضاد الثانوي المترافق على كل ورقة. قرص واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. اغسل الجهاز ب 30 مل من PBS عن طريق التحريك الميكانيكي لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة.

أخيرا ، أضف خمسة ميكرولترات من خليط الركيزة الملونة والمتري على كل ورقة. احتضن التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة وقم بمسح التغيير الناتج في كثافة اللون الموضعي باستخدام ماسح ضوئي لسطح المكتب. للبدء ، قم بعزل الأقراص الورقية الفردية عن الجهاز السائب عن طريق قطع مناطق من صفائح البوليسترين الزائدة باستخدام مقص أو شفرة حلاقة.

ضع كل قرص ورقي في جهاز طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 ملليلتر. اثنان من الحويصلات الملتقطة عن طريق إضافة 265 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل. و 35 ميكرولتر من حامل إزالة السكريات القائم على PVP إلى كل دوامة أنبوبية بقوة.

لضمان الحويصلة الكاملة والتحلل والإزاحة لجزيئات الحمض النووي الريبي المحررة ، أضف 30 ميكرولترا من المحلول المتجانس إلى دوامة المحللة لخلط واحتضان الأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أضف 330 ميكرولترا من خليط كلوروفورم الفينول الحمضي إلى المحللة لضمان الفصل المناسب للطور المحدد للحمض النووي الريبي عن كل من البروتينات ودوامة الحمض النووي بقوة لمدة 15 ثانية على الأقل لكل أنبوب. الطرد المركزي الأنبوب بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق.

في درجة حرارة الغرفة ، انقل الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على الطور المائي العلوي إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر وتخلص من المرحلة العضوية السفلية. أضف 1.25 حجما مائيا بقيمة 100٪ من الإيثانول إلى الحمض النووي الريبي والدوامة لفترة وجيزة للخلط. ثم ضع الخليط على عمود استخراج صلب RNA تجاري.

قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة وتخلص من التدفق عبر الكسر. اغسل العمود بإضافة 700 ميكرولتر من محلول العمل. أولا ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس إلى 10 ثوان وتخلص من التدفق من خلاله.

بعد ذلك ، اغسل العمود ب 500 ميكرولتر من محلول العمل. رقم اثنين ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس إلى 10 ثوان. تخلص من التدفق وكرر الغسيل مرة أخرى.

قم بإزالة أي إيثانول متبقي مع الدوران لمدة دقيقة أخيرة في درجة حرارة الغرفة وانقل عمود الاستخراج المجفف إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. أضف 100 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي المسخن مسبقا. قم بالطرد المركزي للأنبوب بأقصى سرعة لمدة خمس إلى 10 ثوان وتخلص من عمود الاستخراج العلوي إذا لزم الأمر.

قم بتركيز وتنقية الحمض النووي الريبي EIT باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي التجارية باستخدام البيوتين المسمى بالفلورسنت. كمراسل لتعبئة السطح. يمكن رؤية فعالية وخصوصية بروتوكول وظيفية الورق من خلال مقارنة التألق العالي المتكبد على السطح المعدل بالرابط المتقاطع على أسطح الورق غير الوظيفية.

علاوة على ذلك ، عندما يتم استبدال جزيء المراسل بجسم مضاد مضاد للبيوتينيل CD 63 ، فإن الركيزة الورقية التي تعمل بشكل صحيح ستسهل معدل التقاط حوصلة خارج الخلية أعلى على ركيزة ورق التحكم السلبية. عندما يتم تثبيت جزيئات الالتقاط المختلفة على ركائز الورق ، يبدو أن مجموعات فرعية مختلفة من الحويصلات خارج الخلية تظهر توزيعات مختلفة الحجم باستخدام جهاز الورق. يمكن للمرء أيضا فحص كل من محتوى الحمض النووي الريبي داخل المثانة ووفرة البروتينات السطحية الخاصة بالحويصلة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وتلبية احتياجات الارتفاع خارج الخلية باستخدام جهاز ورقي.