أجهزة الورقية للعزل وتوصيف خارج الخلية الحويصلات
April 3rd, 2015
هذا البروتوكول تفاصيل طريقة لعزل الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية)، والجسيمات غشائي صغيرة أطلق سراحهم من الخلايا، من اقل من 10 عينات مصل ميكرولتر. هذا النهج تلتف الحاجة إلى تنبيذ فائق، لا يتطلب سوى بضع دقائق من الوقت الفحص، وتمكن من عزل المركبات الكهربائية من عينات من وحدات التخزين محدودة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الحويصلات خارج الخلية باستخدام منصة ورقية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التصفيح أولا باستخدام لوحين من البوليسترين مع السليلوز الدائري ، وقواطع الورق محاذاة على مجموعة من الثقوب المسجلة. الخطوة الثانية هي اقتران الجزيئات كيميائيا التي من شأنها أن تربط الحويصلات خارج الخلية بمنطقة الاختبار الورقية.
بعد ذلك ، يمكن سحب العينة البيولوجية مباشرة على منطقة اختبار الورق ، ويتم عزل الحويصلات خارج الخلية بعد خطوة الشطف. الخطوة الأخيرة هي توصيف الحويصلات خارج الخلية التقاطها باستخدام المجهر الإلكتروني أو إليزا أو تحليل النسخ. في النهاية ، يمكن تنقية وتركيز مجموعات فرعية من الحويصلات خارج الخلية من عينات مصل صغيرة تصل إلى 10 ميكرولتر.
لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل التعليم الفائق هي أنها تجميعها لطيفة للغاية وسهلة الأداء. سيكون إظهار الإجراء طالبا في الدراسات العليا ، هل يجب عليك. بدءا من ورقتين من البوليسترين ، قم بإنشاء مجموعة من القواطع الدائرية.
كل منها يعرض قطره أقل من خمسة ملليمترات إما مع ثقب يدوي أو كاد ، راسمة قاطعة آلية. بالإضافة إلى ذلك ، قم بقص سلسلة من الكروماتوغرافيا التي يبلغ قطرها خمسة ملليمترات ، وأقراص ورقية مع ثقب. ضع ورقة بوليسترين واحدة على المقعد وقم بتراكب قرص ورقي واحد فوق كل فتحة مقابلة.
ضعالأقراص الورقية عن طريق تسجيل الورقة الثانية من البوليسترين وتراكبها. تحقق من المحاذاة الكلية قبل ربط الساندويتش في آلة تغليف حرارية. بعد ذلك ، ابدأ تعديلات السطح الكيميائي على الأقراص الورقية عن طريق إدخال الجهاز الرقائقي في غرفة البلازما.
قم بتنشيط سطح الورق لفترة وجيزة باستخدام بلازما الأكسجين عند تحرير فراغ الغرفة ، وانقل جهاز الورق على الفور إلى محلول السيلين واحتضانه لمدة 30 دقيقة. اضبط درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة الممرات الزائدة عن طريق شطف الجهاز بخمسة ملليلتر من 200 إيثانول برهان.
ثم احتضان الجهاز بمحلول رابط A-G-M-B-S لمدة 15 دقيقة. اضبط درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة جزيء الرابط الزائد بكميات وفيرة من شطف الإيثانول.
بعد ذلك ، احتضن الجهاز مع أفادون لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية وقم بإزالة أفادون غير المرتبط بغسل PBS بسعة خمسة ملليلتر. يمكن للجهاز بعد ذلك المضي قدما إما إلى خطوة ربط الجسم المضاد أو تخزينه عند أربع درجات مئوية لمدة أربعة أسابيع إذا لزم الأمر. عند ماصة توصيل عدن ، ضع 10 ميكرولترات من محلول المانع على مناطق قرص الورق المكشوف واحتضان الورق لمدة 10 دقائق.
في درجة حرارة الغرفة ، كرر إضافة 10 ميكرولتر من محلول الحجب وحضانة درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. مرتين أخريين لإكمال الوظيفة الحيوية لماصة الركيزة الورقية المكشوفة 10 ميكرولترات من جزيئات التقاط البيوتينيل على الأقراص واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحويصلات خارج الخلية ، يمكن أن تكون جزيئات الالتقاط المفضلة إما أجساما مضادة ل CD 63 أو xin خمسة. كرر عملية سحب العينات سعة 10 ميكرولتر وعمليات الحضانة لمدة 10 دقائق.
مرتين أخريين بعد التقاط مرفق الجزيء. اغسل الشقوق الزائدة عن طريق سحب العينات. 10 ميكرولتر من مخزن الغسيل المناسب على كل قرص ورقي.
احتضن الغسيل لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وكرر الغسيل 10 ميكرولتر وخطوات الحضانة لمدة دقيقة مرتين أخريين. الجهاز الورقي الذي يعمل بكامل طاقته جاهز الآن لعزل الحويصلات خارج الخلية عن المصل أو الخلط المائي لمعالجة المصل. اجمع 10 ملليلتر من الدم المحيطي في أنبوب فراغ واقلب الأنبوب برفق خمس مرات.
ضع الأنبوب في وضع رأسي وانتظر لمدة 30 دقيقة. اضبط درجة حرارة الغرفة ، وقم بالطرد المركزي لعينة الدم لمدة 15 دقيقة. اضبط درجة حرارة الغرفة.
انقل طبقة المصل العلوية الشفافة إلى أنبوب بلاستيكي نظيف وتخلص من المرحلة السفلية شبه الصلبة. قم بتنظيف المصل بسرعة طرد مركزي أعلى لمدة 30 دقيقة. اضبط درجة حرارة الغرفة.
انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وقم بإزالة الجسيمات الدقيقة عن طريق تمرير المادة الطافية عبر مرشح 0.8 ميكرومتر. يمكن استخدام المصل المصفى الناتج على الفور أو تخزينه عند سالب 80 درجة مئوية. إذا كان سيتم استخراج الحويصلات خارج الخلية من الفكاهة ، فقم بجمع الخلط المائي من المرضى مباشرة من خلال الإجراءات الغازية وتخزين العينات عند سالب 80 درجة مئوية.
حتى الاستخدام ، ليست هناك حاجة إلى خطوات ترشيح أو توضيح لعينات الخلط الزجاجي. لعزل الحويصلات خارج الخلية عن المصل أو الخلط المائي ، ضع الماصة خمسة ميكرولترات من العينة البيولوجية على كل قرص ركيزة ورقي وظيفي حيوي. احتضن البقعة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وكرر عملية سحب العينات بسعة خمسة ميكرولتر وعمليات الحضانة لمدة دقيقة واحدة.
مرتين أخريين بعد ربط التقارب، اشطف الحويصلات غير المرتبطة عن طريق سحب 10 ميكرولتر من مخزن الغسيل المناسب. احتضن المخزن المؤقت لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وكرر الغسيل 10 ميكرولتر والحضانة اللاحقة. الخطوة مرتين أخريين.
أصبحت الحويصلات خارج الخلية الملتقطة جاهزة الآن للمقايسات النهائية التالية لتثبيت الحويصلات الملتقطة على ماصة دعم الورق الوظيفية 10 ميكرولتر من 0.5 × مثبتة كارنوفسكي على كل قرص ورقي. دع تفاعل الربط المتقاطع يستمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق واشطف جميع الأقراص بكميات وفيرة من PBS لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بتجفيف ركائز الورق عن طريق تطبيق الغسالات التالية بالترتيب.
حضانة واحدة للإيثانول بنسبة 35٪ ، وحضانات إيثانول بنسبة 50٪ ، وحضانتان بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وحضانات 95٪ من الإيثانول ، وأربع حضانات إيثانول بنسبة 100٪. لكل غسلة فردية ، اترك محلول الإيثانول يحتضن أعلى أقراص الورق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. عندما يكون الجهاز الورقي جافا للعظام ، قم بتغطية العينات بطبقة 18 نانومتر من ذهب البلاديوم في رش معدني.
أدخل العينة في المجهر الإلكتروني الماسح وقم بإجراء الفحص المجهري عند خمسة كيلو فولت لمنع الشحن الزائد للعينة البيولوجية للكشف عن الحويصلات الملتقطة عن طريق المقايسات المناعية. ابدأ بإضافة خمسة ميكرولترات من الأجسام المضادة الأساسية المضادة للقرص المضغوط تسعة على كل قرص ورقي واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة جميع الأجسام المضادة غير المرتبطة عن طريق غسل الجهاز الورقي ب 30 مل من PBS بدرجة حرارة الغرفة عن طريق التحريك الميكانيكي.
بعد ذلك ، ضع الماصة خمسة ميكرولترات من فجل الحصان بيروكسيداز الجسم المضاد الثانوي المترافق على كل ورقة. قرص واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. اغسل الجهاز ب 30 مل من PBS عن طريق التحريك الميكانيكي لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة.
أخيرا ، أضف خمسة ميكرولترات من خليط الركيزة الملونة والمتري على كل ورقة. احتضن التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة وقم بمسح التغيير الناتج في كثافة اللون الموضعي باستخدام ماسح ضوئي لسطح المكتب. للبدء ، قم بعزل الأقراص الورقية الفردية عن الجهاز السائب عن طريق قطع مناطق من صفائح البوليسترين الزائدة باستخدام مقص أو شفرة حلاقة.
ضع كل قرص ورقي في جهاز طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 ملليلتر. اثنان من الحويصلات الملتقطة عن طريق إضافة 265 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل. و 35 ميكرولتر من حامل إزالة السكريات القائم على PVP إلى كل دوامة أنبوبية بقوة.
لضمان الحويصلة الكاملة والتحلل والإزاحة لجزيئات الحمض النووي الريبي المحررة ، أضف 30 ميكرولترا من المحلول المتجانس إلى دوامة المحللة لخلط واحتضان الأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أضف 330 ميكرولترا من خليط كلوروفورم الفينول الحمضي إلى المحللة لضمان الفصل المناسب للطور المحدد للحمض النووي الريبي عن كل من البروتينات ودوامة الحمض النووي بقوة لمدة 15 ثانية على الأقل لكل أنبوب. الطرد المركزي الأنبوب بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق.
في درجة حرارة الغرفة ، انقل الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على الطور المائي العلوي إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر وتخلص من المرحلة العضوية السفلية. أضف 1.25 حجما مائيا بقيمة 100٪ من الإيثانول إلى الحمض النووي الريبي والدوامة لفترة وجيزة للخلط. ثم ضع الخليط على عمود استخراج صلب RNA تجاري.
قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة وتخلص من التدفق عبر الكسر. اغسل العمود بإضافة 700 ميكرولتر من محلول العمل. أولا ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس إلى 10 ثوان وتخلص من التدفق من خلاله.
بعد ذلك ، اغسل العمود ب 500 ميكرولتر من محلول العمل. رقم اثنين ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس إلى 10 ثوان. تخلص من التدفق وكرر الغسيل مرة أخرى.
قم بإزالة أي إيثانول متبقي مع الدوران لمدة دقيقة أخيرة في درجة حرارة الغرفة وانقل عمود الاستخراج المجفف إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. أضف 100 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي المسخن مسبقا. قم بالطرد المركزي للأنبوب بأقصى سرعة لمدة خمس إلى 10 ثوان وتخلص من عمود الاستخراج العلوي إذا لزم الأمر.
قم بتركيز وتنقية الحمض النووي الريبي EIT باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي التجارية باستخدام البيوتين المسمى بالفلورسنت. كمراسل لتعبئة السطح. يمكن رؤية فعالية وخصوصية بروتوكول وظيفية الورق من خلال مقارنة التألق العالي المتكبد على السطح المعدل بالرابط المتقاطع على أسطح الورق غير الوظيفية.
علاوة على ذلك ، عندما يتم استبدال جزيء المراسل بجسم مضاد مضاد للبيوتينيل CD 63 ، فإن الركيزة الورقية التي تعمل بشكل صحيح ستسهل معدل التقاط حوصلة خارج الخلية أعلى على ركيزة ورق التحكم السلبية. عندما يتم تثبيت جزيئات الالتقاط المختلفة على ركائز الورق ، يبدو أن مجموعات فرعية مختلفة من الحويصلات خارج الخلية تظهر توزيعات مختلفة الحجم باستخدام جهاز الورق. يمكن للمرء أيضا فحص كل من محتوى الحمض النووي الريبي داخل المثانة ووفرة البروتينات السطحية الخاصة بالحويصلة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وتلبية احتياجات الارتفاع خارج الخلية باستخدام جهاز ورقي.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يفصل هذا البروتوكول طريقة لعزِل الجسيمات خارج الخلية (EVs) من عينات المصل الصغيرة باستخدام منصة ورقية. تتجنب المقاربة استخدام الطرد المركزي الفائق، ولا تتطلب سوى بضع دقائق من وقت الاختبار.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- الجسيمات خارج الخلية
الخلفية
- الجسيمات خارج الخلية هي جزيئات غشائية صغيرة تفرز من الخلايا.
- عزِل الجسيمات خارج الخلية أمر بالغ الأهمية للعديد من التحليلات البيولوجية.
- غالبًا ما تتطلب الطرق التقليدية أحجامًا كبيرة من العينات وفترة معالجة مطولة.
- تتيح هذه الطريقة استخدام عينات مصل محدودة.
هدف الدراسة
- توفير طريقة سريعة وفعالة لعزِل الجسيمات خارج الخلية.
- تمكين تحليل الجسيمات خارج الخلية من عينات بيولوجية صغيرة.
- تسهيل مزيد من التوصيف للجسيمات خارج الخلية المعزولة.
الطرق المستخدمة
- تصفيح صفائح البوليسترين بقصاصات ورقية دائرية من السليلوز.
- الارتباط الكيميائي للجزيئات لربط الجسيمات خارج الخلية بالمنطقة الاختبارية الورقية.
- تقطير العينات البيولوجية إلى منطقة الاختبار الورقية.
- توصيف الجسيمات خارج الخلية المأخوذة باستخدام المجهر الإلكتروني، ELISA، أو التحليل التناسخي.
النتائج الرئيسية
- يمكن عزِل الجسيمات خارج الخلية من 10 ميكرولتر من المصل فقط.
- الطريقة سريعة وتتجنب الحاجة إلى الطرد المركزي الفائق.
- يمكن توصيف الجسيمات خارج الخلية المعزولة بشكل فعال.
- تعزز هذه المقاربة إمكانية الوصول إلى تحليل الجسيمات خارج الخلية في البحث.
الاستنتاجات
- المنصة الورقية هي بديل قابل للتطبيق لعزِل الجسيمات خارج الخلية.
- يمكن لهذه الطريقة أن تبسط بشكل كبير أبحاث الجسيمات خارج الخلية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه التقنية لتطبيقات مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Efficient isolation and characterization of extracellular vesicles (EVs) is a critical bottleneck in translational biomarker discovery and early-stage drug development. This paper-based immunoaffinity platform enables rapid, low-volume EV capture and analysis, reducing reliance on ultracentrifugation and large sample inputs. The approach supports scalable, reproducible workflows for EV-based target validation and mechanistic de-risking across discovery and preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of EV subpopulations for pathway and target validation.
- Supports mechanistic de-risking by isolating disease-relevant EVs from minimal samples.
- Facilitates rapid hypothesis testing with quantitative EV marker analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV samples for downstream phenotypic or molecular assays.
- Standardizes EV isolation for reproducible, quantitative readouts in screening workflows.
- Enables scalable assay development with minimal sample and equipment requirements.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV isolation with translational biomarker strategies using clinically relevant fluids.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting RNA and protein profiling of EVs.
- Reduces risk of sample loss or degradation, supporting robust preclinical decision-making.
Pipeline & Workflow Integration
This paper-based EV isolation method integrates from early discovery through preclinical research, enabling rapid sample processing and downstream molecular characterization.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and target de-risking by enabling selective EV capture and analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative EV isolation for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Supports SEM, ELISA, and transcriptomic readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by isolating EVs from clinically relevant fluids with minimal input.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable platform adaptable across disease models and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in EV-based studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with standardized, low-volume, and equipment-light protocols.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient biomarker and target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling robust, reproducible EV analytics across programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoaffinity chemistry and EV biology for optimal marker selection.
- Needs access to basic laboratory equipment and analytical tools such as SEM and ELISA readers.
- Demands cross-team standardization of capture molecules and assay conditions for reproducibility.
- Adaptable to various biological fluids but may require protocol optimization for different matrices.
- Sample input limitations and marker specificity must be considered for translational applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Fabrication of Paper Devices
4:04
Serum and Aqueous Humor Sample Collection and Processing
5:09
Isolation of Extracellular Vesicles
5:56
Downstream Assay Example 1: Scanning Electron Micoscopy
7:04
Downstream Assay Example 2: Paper-based ELISA
8:04
Downstream Assay Example 3: RNA Isolation
10:26
Results: Characterization of Captured Extracellular Vesicles
11:24
Conclusion
