تطبيق نظام التعبير محرض لدراسة التدخل من العوامل البكتيرية الفوعة مع اشارة بين الخلايا

الهدف العام من التجربة التالية هو دراسة تداخل عوامل الضراوة البكتيرية مع التأشير داخل الخلايا. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء خطوط خلوية مستقرة تعبر عن البروتين محل الدراسة. وفي خطوة ثانية، يتم إنشاء نظام ناقل تعبير قابل للتحفيز لدراسة نشاط البروتين على مستوى الخلايا الكلي، مما يسمح بتنشيط شلال التأشير في الخلية المضيفة عند خطوة محددة. بعد ذلك، سيتم تحليل ما إذا كان البروتين محل الدراسة يمكنه التداخل مع تنشيط شلال التأشير في الخلية المضيفة من أجل تحديد نقطة نشاط البروتين بدقة. وتظهر النتائج أن عامل الضراوة KA B الخاص بـ cozy yellow Burnett يتداخل مع شلال الموت الخلوي المبرمج (apoptotic cascade) في مرحلة تالية لـ backs وسابقة لتنشيط cascade three، وذلك استناداً إلى تحليل لطخة ويسترن (western blotting).

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال البيولوجيا المعدية، مثل تحديد الخطوة الرئيسية في شلال نقل الإشارة التي يتدخل عندها بروتين مؤثر بكتيري معين. لن يساعدنا هذا في فهم كيفية تلاعب الكائنات الدقيقة الممرضة بمضيفيها بشكل أفضل فحسب، بل وأيضاً في فهم كيفية عمل هذه العمليات الخلوية الأساسية. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول الاستراتيجيات البكتيرية لمنع حدوث الموت الخلوي المبرمج (apoptosis)، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة نقل إشارة أخرى في مجال موت الخلايا، مثل necrosis أو pyroptosis، أو أيضاً على شبكات الإشارات المشاركة في تكاثر الخلايا، أو تنظيم الجينات، أو استجابات الجهاز المناعي.

ستقوم ستيفاني بيسلر، طالبة الدراسات العليا من مختبر مان، بتوضيح هذا الإجراء. ابدأ هذا الإجراء باستزراع خلايا HEK 2 93 التي تعبر باستقرار عن GFP أو GFP, say B في صفيحة ذات 12 بئرًا بكثافة 100, 000 خلية لكل بئر.

بعد ذلك، قم بتحضير الـ DNA وكاشف ترانسفكشن البولي إيثيلين بشكل منفصل في 75 µL من وسط opt، واتركهما للتحضين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوين المعقدات. قم بتحضين كلا الخليطين معاً لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف محلول البولي إيثيلين DNA قطرة تلو الأخرى إلى الخلايا، ثم قم بتحضينها عند 37 °C في 5% carbon dioxide.

بعد مرور خمس ساعات من عملية عفن الخلايا (transfection)، يتم تحفيز تعبير البروتينات المحفزة للموت الخلوي المبرمج عن طريق إضافة 1 µg/mL من الدوكسيسيكلين (doxycycline) إلى وسط الزرع. ثم تُحضن الخلايا لمدة 18 ساعة عند 37 °C في 5% CO2 تحت المجهر الضوئي. يتم فحص الخلايا للتأكد من تحريض الموت الخلوي قبل عملية الحصاد.

افحص الخلايا التي تعرضت للاستحثاث الموت الخلوي المبرمج، والتي يمكن الكشف عنها من خلال وجود أجسام الموت الخلوي المبرمج. بعد ذلك، قم بإزالة الطافي وغسل الخلايا الملتصقة. مرة واحدة باستخدام PBS دافئ، أعد تعليق الخلايا في 100 µL من منظم عينات لامبي (lamby sample buffer) بتركيز 2x.

ثم يتم التسخين لمدة خمس دقائق عند 95 °C، وتُخزن العينات لاحقاً عند -20 °C. بعد ذلك، يتم تحميل 6 µL من سلم بروتيني تجاري كعلامة للوزن الجزيئي. ثم يتم تحميل ما يقرب من 40,000 خلية لكل عينة على هلام SDS page بتركيز 12%.

قم بتشغيل الهلامات في نظام الرحلان الكهربائي للهلام تحت جهد ثابت قدره 180 فولت لمدة تتراوح بين 45 إلى 60 دقيقة باستخدام محلولاً منظماً للتشغيل بتركيز 1x laly. بعد ذلك، قم بنقل البروتينات إلى أغشية PVDF تحت جهد ثابت قدره 16 فولت لمدة 60 دقيقة، باستخدام خلية نقل شبه جافة trans blot SD، ثم قم بحجب الأغشية في 10 milliliters من MPT لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

خفف سبعة µL من الأجسام المضادة لبروتين cleaved PARP في سبعة mL من MPT. حضن غشاء PVDF مع محلول الأجسام المضادة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. أزل محلول الأجسام المضادة واجرِ ثلاث عمليات غسل لمدة 10 دقائق باستخدام PBS 0.05%Tween 20، ثم حضن الأغشية مع 1.4 µL من الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بإنزيم horse radish peroxidase والمخففة في سبعة mL من MPT لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد عملية التحضين.

اغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام PBS 0.05%Tween 20، ثم اكشف عن نشاط بيروكسيداز الفجل (horseradish peroxidase) باستخدام طقم تجاري وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. واستخدم معدات تطوير الأفلام القياسية لتصور حزم البروتين. بعد ذلك، قم بإزالة الأجسام المضادة المرتبطة عن طريق تحضين الأغشية مع سبعة ملليلتر من محلول إزالة ارتباط لطخة ويسترن (western blot stripping buffer) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد ثلاث غسلات بـ PBS 0.05%Tween 20، ثم افحص الأغشية باستخدام أربعة ميكرولتر من الجسم المضاد للأكتين (anti actin) في أربعة ملليلتر من MPT طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي، يتم إجراء ثلاث خطوات غسيل لمدة 10 دقائق لكل خطوة للأغشية باستخدام 10 ملي لتر تقريبًا من PBS 0.05%Tween 20، ثم تُحضن الأغشية مع 1.4 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بإنزيم horse radish peroxidase والمخففة في سبعة ملي لتر من MPT. بعد ساعة واحدة من التحضين في درجة حرارة الغرفة، تُغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام PBS 0.05%Tween 20، ويتم الكشف عن نشاط horse radish peroxidase باستخدام طقم تجاري، وتُستخدم المعدات القياسية لتحميض الأفلام لتصور حزم البروتين. في هذه التجربة، تم إجراء تحليل immuno blooded للمستخلصات الخلوية الكاملة لخلايا HEK 2 93 GFP وHEK 2 93 GFP sabe للكشف عن GFP لإظهار التعبير المستقر.

يُظهر تحليل قياس التدفق الخلوي التمثيلي لخلايا HEK 2 93 GFP وخلايا HEK 2 93 GFP sabe كثافة تعبير GFP. عولجت خلايا HEK 2 93 GFP وخلايا HEK 2 93 GFP sabe بتركيز 4 µM من مادة sporin لمدة ست ساعات لتحفيز موت الخلايا المبرمج الداخلي. تم تحليل موت الخلايا المبرمج عن طريق تحليل لطخة مناعية لبروتين PARP المقطع، حيث وُجد أن انقسام PARP قد انخفض في خلايا HK 2 9 3 GFP SA B مقارنة بخلايا HK 2 93 GFP.

يحمي CB من الموت الخلوي المبرمج الناجم عن bax، ولكن ليس من الموت الخلوي المبرمج الناجم عن caspase three. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم فحص أكبر عدد ممكن من مكونات مسار التأشير للمساعدة في تحديد خطوة التفاعل. كما يُستحسن اختبار البروتينات التي يتم تنشيطها في كل من حالتيها الأساسية والنشطة لتحديد ما إذا كان البروتين المؤثر المختار يتداخل مع المسار نفسه، أو بالأحرى مع خطوة التنشيط التي تلي هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل إسكات الجينات (knockdown)، أو تعطيل الجينات (knockout)، أو اختبار الهجين الثنائي للخميرة (yeast two hybrid)، أو الترسيب المناعي (pull down)، أو مقايسات تعديل ما بعد الترجمة أو استقرار التحلل البروتيني للإجابة على أسئلة إضافية، مثل: ما هي الآليات الجزيئية الدقيقة التي تستخدمها هذه المؤثرات الميكروبية للتلاعب بالفيزيولوجيا الطبيعية لخلية المضيف؟ وكيف يفيد ذلك في بقاء الممرض وانتشاره.