تطبيق نظام التعبير محرض لدراسة التدخل من العوامل البكتيرية الفوعة مع اشارة بين الخلايا

تستخدم الطريقة الموضحة هنا للحث على سلسلة إشارات موت الخلايا المبرمج في خطوات محددة من أجل تشريح نشاط بروتين المستجيب البكتيري المضاد لموت الخلايا المبرمج. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للتعبير المحفز عن البروتينات المؤيدة لموت الخلايا المبرمج أو السامة ، أو لتشريح التداخل مع مسارات الإشارات الأخرى.

الهدف العام من التجربة التالية هو دراسة تداخل عوامل الفوعة البكتيرية مع الإشارات داخل الخلايا. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء خطوط خلوية مستقرة ، معبرة عن البروتين محل الاهتمام لدراسة نشاطه على مستوى الخلية السائبة كخطوة ثانية ، يتم إنشاء نظام متجه للتعبير المحفز ، والذي يسمح بتنشيط سلسلة إشارات الخلية المضيفة في خطوة محددة. بعد ذلك ، سيتم تحليل ما إذا كان البروتين محل الاهتمام يمكن أن يتداخل مع تنشيط سلسلة إشارات الخلية المضيفة من أجل تضييق نطاق نشاط البروتين محل الاهتمام ، وتظهر النتائج أن عامل ضراوة بورنيت الأصفر المريح KA B يتداخل مع الشلال موت الخلايا المبرمج في اتجاه مجرى الظهر وأعلى التنشيط الثالث من الشلال بناء على تحليل النشاف الغربي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا المعدية ، مثل تحديد الخطوة الرئيسية في سلسلة نقل الإشارة التي يتداخل فيها بروتين مستجيب بكتيري معين. لن يساعدنا هذا فقط على فهم أفضل لكيفية معالجة الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض مع مضيفيها ، ولكن أيضا كيف تعمل هذه العمليات الخلوية الأساسية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للاستراتيجيات البكتيرية لمنع موت الخلايا المبرمج من الحدوث ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة نقل الإشارات الأخرى في مجال موت الخلايا ، مثل ONS أو تدلي الجفون ، أو أيضا على شبكات الإشارات التي تشارك في تكاثر الخلايا أو تنظيم الجينات أو تفاعلات الجهاز المناعي.

ستظهر هذا الإجراء ستيفاني بيسلر ، طالبة دراسات عليا من مختبر مان. ابدأ هذا الإجراء عن طريق زرع خلايا HEK 2 93 التي تعبر بثبات عن GFP أو GFP ، على سبيل المثال B في 12. صفيحة البئر بكثافة 100 ، 000 خلية لكل بئر.

بعد ذلك ، قم بإعداد كاشف الحمض النووي والبولي إيثيلين بشكل منفصل في 75 ميكرولترا من وسط الاختيار ، واحتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوين معقد. احتضان كلا الخليطين معا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف محلول البولي إيثيلين DNA بالتنقيط إلى الخلايا واحتضانه عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد خمس ساعات من التعدي ، قم بتحفيز التعبير عن البروتينات المبرمج المؤيدة عن طريق إضافة ميكروغرام واحد لكل مليلتر من الدوكسيسيكلين إلى وسط الاستزراع. ثم احتضان الخلايا لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون تحت المجهر الضوئي. افحص الخلايا بحثا عن تحريض موت الخلايا قبل الحصاد.

افحص الخلايا المبرمجة المستحثة ، والتي يمكن اكتشافها من خلال وجود أجسام موت الخلايا المبرمج. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وغسل الخلايا الملتصقة. مرة واحدة مع PBS دافئة ، قم بإعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من عينة لامبي اثنين من العازلة.

ثم سخنيها لمدة خمس دقائق عند 95 درجة مئوية وتخزينيها في وقت لاحق على درجة حرارة سالب 20 درجة مئوية بعد ذلك. بعد ذلك ، قم بتحميل ستة ميكرولترات من سلم البروتين التجاري كعلامة للوزن الجزيئي. ثم قم بتحميل ما يقرب من 40,000 خلية لكل عينة على هلام صفحة SDS بنسبة 12٪.

قم بتشغيل المواد الهلامية في نظام الرحلان الكهربائي الهلامي تحت جهد ثابت يبلغ 180 فولت لمدة 45 إلى 60 دقيقة مع عازلة تشغيل واحدة × laly. بعد ذلك ، قم بعمل البروتينات على أغشية PVDF بجهد ثابت يبلغ 16 فولت لمدة 60 دقيقة. باستخدام خلية نقل شبه جافة من SD ، ثم قم بسد الأغشية في 10 ملليلتر من MPT لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

خفف سبعة ميكرولترات من الجسم المضاد PARP المضاد للشقوق في سبعة ملليلتر من MPT. احتضان غشاء PVDF بمحلول الجسم المضاد طوال الليل عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة محلول الجسم المضاد وقم بإجراء ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق باستخدام PBS 0.05٪ Tween 20 ، واحتضان الأغشية ب 1.4 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع فجل الحصان بيروكسيداز المخففة في سبعة مل من MPT لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة.

اغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام PBS 0.05٪ Tween 20 ، واكتشف نشاط بيروكسيداز الفجل الحار باستخدام مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. وتطبيق المعدات القياسية لتطوير الأفلام لتصور نطاقات البروتين. ثم قم بإزالة الأجسام المضادة المرتبطة عن طريق احتضان الأغشية بسبعة ملليلتر من المخزن المؤقت لتجريد اللطخة الغربية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد ثلاث غسلات باستخدام PBS 0.05٪ Tween 20 ، قم بفحص الأغشية بأربعة ميكرولترات من الجسم المضاد للأكتين في أربعة ملليلتر من MPT بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، قم بإجراء ثلاث خطوات غسيل مدتها 10 دقائق على الأغشية بحوالي 10 ملليلتر من PBS 0.05٪ Tween 20 ، ثم احتضان الأغشية ب 1.4 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة لفجل الحصان بيروكسيداز المخففة في سبعة ملليلتر من MPT بعد ساعة واحدة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام PBS 0.05٪ Tween 20 ، واكتشف نشاط بيروكسيداز فجل الحصان باستخدام مجموعة تجارية وقم بتطبيق المعدات القياسية لتطوير الفيلم لتصور حظر البروتين. في هذه التجربة ، تم تحلل الخلايا الكاملة لخلايا HEK 2 93 GFP و HEK 2 93 GFP sabe بدم مناعي ل GFP لإظهار تعبير مستقر.

يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي التمثيلي لخلايا HEK 2 93 GFP و HEK 2 93 GFP sabe شدة تعبير GFP. تمت معالجة خلايا HEK 2 93 GFP و HEK 2 93 GFP sabe بأربعة ميكرومولار سبورين لمدة ست ساعات للحث على موت الخلايا المبرمج الجوهري. تم تحليل موت الخلايا المبرمج عن طريق تحليل اللطخة المناعية المشقوقة PARP حيث وجد أن انقسام PARP ينخفض في خلايا HK 2 9 3 GFP SA B مقارنة بخلايا HK 2 93 GFP.

يحمي CB من موت الخلايا المبرمج الناجم عن bax ، ولكن ليس من موت الخلايا المبرمج المستحث بثلاثة كاسباز أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم فحص أكبر عدد ممكن من مكونات مسار الإشارات للمساعدة في تحديد خطوة التفاعل. من الجيد أيضا اختبار البروتينات التي يتم تنشيطها في كل من حالتها الأرضية والمنشطة لتحديد ما إذا كان بروتين المستجيب المختار يتداخل مع المسار نفسه ، أو بالأحرى مع خطوة التنشيط بعد هذا الإجراء.

إجراء طرق أخرى مثل ضربة قاضية أو خميرة بالضربة القاضية أو اثنين من التعديل الهجين القابل للسحب أو فحوصات الاستقرار المحلل للبروتين للإجابة على أسئلة إضافية مثل ، ما هي الآليات الجزيئية الدقيقة التي تستخدمها هذه المؤثرات الميكروبية لمعالجة فسيولوجيا الخلية المضيفة الطبيعية؟ وكيف يفيد هذا بقاء مسببات الأمراض وانتشارها.