الجزيئية التحقيق الأمثل لتحديد معدل الوفيات خلية في الكائن الضوئي (

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية إنشاء بروتوكول يمكنه تحليل الحالة الفسيولوجية للبكتيريا الزرقاء (cyanobacteria) بفعالية، باستخدام قياس التدفق الخلوي والمجسات الجزيئية. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في الإجابة على أسئلة رئيسية حول فسيولوجيا الخلايا في المجتمعات الميكروبية. تكمن الميزة الرئيسية لهذا الإجراء في أن بروتوكول المجس الفلوري المحسّن يمكنه التمييز بين الحالات الفسيولوجية للبكتيريا الزرقاء على مستوى الخلية الفردية في الوقت الفعلي.

سيقوم ديفيد هارتنيل، طالب الدكتوراه العامل في مختبر قياس التدفق الخلوي بجامعة بورنموث، بشرح هذا الإجراء. قبل البدء في التجربة، ضع أنبوبة تحليل دم فارغة على مسبار حقن العينة، ثم انقر فوق "unclog".

ثم يتم إجراء الغسيل العكسي لبدء عملية تنظيف قياس التدفق الخلوي. وفي نهاية الغسيل العكسي، يتم تحميل أنبوب تحلل دموي جديد يحتوي على 2 mL من الماء المفلتر فائق النقاء على مسبار حقن العينة (SIP)، مع ضبط الحد الزمني من 10 إلى 15 دقيقة، وسرعة تدفق السوائل على الوضع السريع. بعد ذلك، يتم اختيار خلية بيانات جديدة، وضبط عتبات الفلورة وتشتت الضوء ذات الصلة لتقليل ضوضاء الخلفية.

ثم انقر فوق تشغيل. إذا لم يكن إجمالي الأحداث في الثانية أقل من توصية الشركة المصنعة، فقم بتشغيل 2 mL من محلول إزالة التلوث لمدة دقيقتين على الوضع السريع. ثم كرر خطوات الغسيل العكسي والغسل بالماء فائق النقاء.

لتحضير مزرعة نقية أولية من *M.aeruginosa*، قم بتعقيم 98 ملليلتر من الماء المفلتر فائق النقاء، ممزوجاً بملليلترين من الوسط الطحلبي، في دورق سعة 250 ملليلتر باستخدام الموصدة (autoclave) لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 120 درجة مئوية. وعندما تصل المزرعة إلى كثافة عالية في حالة مستقرة، قم بتفكيك تجمعات ملليلترين من الخلايا عن طريق الرج الدوامي (vortexing)، ثم انقل الخلايا إلى أسفل مسبار حقن العينة.

تأكد من توزيع الخلايا بشكل متساوٍ باستخدام المجهر الضوئي. بعد ذلك، اختر مخطط المدرج التكراري (histogram plot) في برنامج جهاز قياس التدفق الخلوي لتسجيل بيانات تشتت الضوء الأمامي (forward light scatter). ثم انقر على "log" لعرض البيانات بمقياس لوغاريتمي على المحور السيني (x-axis).

في مخرج منفصل، قم بضبط مخطط مدرج تكراري بمحور لوغاريتمي آخر لتسجيل الفلورة الطبيعية لخلايا M.aeruginosa. بعد ذلك، اختر مصدر ضوء يمكنه استثارة الفيكوسيانين، وكاشفاً يمكنه تصفية الانبعاثات الناتجة عن الفلورة. وللتسجيل بأعلى دقة، اختر الإعدادات الأقرب إلى الحجم الأساسي للكائن المستهدف.

وقم بضبط معدل تدفق بطيء نسبياً. وقبل الحصول على البيانات، حدد عتبة لاستبعاد أي إشارات تشتت ضوئي أو فلورية ناتجة عن الضوضاء الإلكترونية الخلفية أو حطام عينة الخلايا. ثم اختر خلية بيانات جديدة.

أنشئ مخطط كثافة (density plot) بمعلمات التشتت الأمامي والجانبي على مقياس لوغاريتمي، ثم انقر فوق "تشغيل" (run). الآن، قم بتطبيق بوابة التشتت الضوئي الأمامي والفلورة الطبيعية على بيانات التشتت الأمامي مقابل الجانبي لاستبعاد أي إشارات تشتت منخفضة المستوى، ولتضمين إشارات الفيكوسيانين ذات الفلورة النسبية العالية فقط. بعد ذلك، قم بجمع الأحداث حتى تنتهي العينة، واستخدم البيانات لتحديد عدد الخلايا الأولي.

لتحسين عملية امتصاص الخلايا للمسبار الجزيئي، يتم تعريض نصف المزارع الأحادية التي تم تحضيرها مسبقاً للظروف المناسبة لإنشاء ضابط موت (dead control). تحقق من التغيرات في البيئة الدقيقة للعينة للتأكد من موت المزرعة، ثم قم بتفكيك التجمعات الاستعمارية كما تم توضيحه للتو.

بعد ذلك، اختر ليزراً بطول موجي 488 nanometer إلى جانب كاشف يمكنه تسجيل الفلورة من مجسات الحمض النووي الخضراء والبرتقالية. واستخدم ليزر 640 nanometer لتسجيل إشارات الفيكوسيانين عبر الكواشف الخاصة بها. وفي ورقة بيانات جديدة، قم بإعداد مخطط كثافة (density plot) بمعايير التشتت الأمامي والجانبي.

بعد ذلك، قم بإنشاء مخطط مدرج تكراري واحد باستخدام قناة كاشف الضوء للمسبار الجزيئي المعني. مخطط مدرج تكراري واحد للكشف عن انبعاثات الفيكوسيانين، ومخطط مدرج تكراري واحد لأحداث التشتت الأمامي، على أن تكون جميعها بمقياس لوغاريتمي. قم بتشغيل عينات البكتيريا الزرقاء باستخدام تركيزات وأوقات تحضين مختلفة.

قم بإنشاء بوابة في مخطط التوزيع التكراري للتشتت الأمامي (forward scatter histogram) لتشمل الأحداث التي تتوافق فقط مع حجم خلية الكائن المستهدف، ثم قم بتطبيقها على قناة مسبار الفلورة المقابلة. بعد ذلك، وفي قناة مسبار الفلورة، أنشئ بوابة برمجية شاملة أخرى مقابل أعلى ذروة في مخطط التوزيع التكراري.

وبعد ذلك، يتم تحديد البوابة (gate) لفلورة المسبار الإيجابية المقابلة على مخطط الكثافة. قارن عدد إشارات الفلورة بعدد خلايا التحكم الميتة، حيث يتم تحديد أعلى نسبة لامتصاص المسبار النووي الخلوي التي لا تنتج صبغاً غير نوعي. لاختبار تداخل الفلورة الناتج عن الصبغ الخلوي الذاتي أو غير النوعي، اختر بيانات المزرعة المختلطة المكونة من 50% من الخلايا الحية و50% من الخلايا الميتة.

ثم قم بإزالة بوابات الفلورة. طبق البوابات بحيث تشمل فقط مدرج التوزيع التكراري للتشتت الأمامي لحجم خلية الكائن المستهدف في مدرج توزيع قناة الفيكوسيانين. قم بتحديد بوابات لأعلى وأدنى قمم الفيكوسيانين، وتسميتها "حية" و"ميتة" على التوالي.

بعد ذلك، قم بتطبيق البوابات بشكل منفصل على إشارات الفيكوسيانين للخلايا الحية والميتة، وسجّل متوسط طول الموجة لكل منهما. ولتحديد حساسية البروتوكول، احسب نسبة متوسط أطوال الموجات لفلورية المسبار الجزيئي الإيجابي للخلايا الميتة إلى الإشارة الحية غير النوعية الجوهرية.

أخيرًا، اختر البروتوكول الأمثل الذي تم فيه صبغ أكبر عدد من الخلايا الميتة دون حدوث صبغ غير محدد. تظهر هذه الرسوم البيانية مخرجات تشتت الضوء الأمامي والجانبي التمثيلية، والتي تعبر عن الحجم الخلوي والتعقيد الداخلي لمزرعة دفعية من *M.aeruginosa* في طور النمو الأسي. يمكن إجراء عملية تحديد البوابات (Gating) عن طريق تنقية البيانات بين نقاط معينة من مخرجات تشتت الضوء الأمامي.

يُنتج الفيكوسيانين إشارة قوية عند استثاره بمصدر ضوء أحمر، والتي يمكن استخدامها لمزيد من تحديد بوابات المجموعات الخلوية ذات الأهمية. ومن خلال تشتت الضوء الأمامي وإشارات الفلورة، يمكن حينئذٍ تحديد البوابات من المخرجات الأصلية للبيانات، وصولاً إلى بيانات محددة عن عينة *M.aeruginosa* لإجراء العد النهائي للخلايا. وعند خلط ضوابط حية عالية التصبغ مع ضوابط ميتة منخفضة التصبغ، يصبح الانزياح التناقصي في الفلورة الذاتية واضحاً.

في الخلايا ذات الغشاء المتضرر، تنتج مجسات الحمض النووي إشارة إضافية يمكن رصدها بواسطة قياس التدفق الخلوي وتأكيدها لاحقاً بواسطة مجهر الفلورة فوق البنفسجية. ويزداد التمييز الفلوري بين الخلايا الحية والميتة مع مرور الوقت عند التركيزات ما بين 0.05 و0.5 micromolar، ولكنه ينخفض بين تركيزات 1 و100 micromolar لكلا المسبارين. وبالفعل، يبدو أن التركيز الأمثل لمسبار الحمض النووي الأخضر هو 0.5 micromolar مع مدة حضانة تبلغ 30 دقيقة.

بالنسبة لمسبار الحمض النووي البرتقالي، يكون التركيز الأمثل 1 micromolar لفترة تحضين مدتها 10 دقائق. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمام عملية التحسين لكل مسبار جزيئي في غضون يوم واحد، إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على المسابير في بيئة مستقرة، تحت ظروف مناسبة من درجة الحرارة، والـ pH، والإضاءة.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة لاستكشاف التباين المجتمعي في العوالق النباتية. بعد مشاهدة الفيديو، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية تطوير بروتوكول مثالي لتقييم الفسيولوجيا الخلوية باستخدام قياس التدفق الخلوي والمجسات الجزيئية. لا تنسَ أن العمل مع المجسات الجزيئية والكائنات السامة يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية (P.P.E) المناسبة، والإلمام الكامل بمواد تقييم مخاطر المواد الخطرة على الصحة (COSHH) أثناء تنفيذ هذا الإجراء.