الجزيئية التحقيق الأمثل لتحديد معدل الوفيات خلية في الكائن الضوئي ( Microcystis الزنجارية) باستخدام التدفق الخلوي
يناير 29, 2016
السكان الميكروبية تحتوي على التجانس الخلية كبيرا، وهو ما يمكن أن تملي السلوك العام. تحليل المسبار الجزيئي من خلال التدفق الخلوي يمكن تحديد الدول الفسيولوجية للخلايا، ولكن تطبيقه يختلف بين الأنواع. وتقدم هذه الدراسة بروتوكول لتحديد بدقة وفيات خلية ضمن مجموعة من السكان cyanobacterium، دون التقليل أو تسجيل نتائج إيجابية كاذبة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية إنشاء بروتوكول يمكنه تحليل الحالة الفسيولوجية للبكتيريا الزرقاء بشكل فعال ، باستخدام قياس التدفق الخلوي والمجسات الجزيئية. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول فسيولوجيا الخلية للمجتمعات الميكروبية. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أن بروتوكول مسبار الفلورسنت المحسن يمكن أن يميز بين الحالات الفسيولوجية للبكتيريا الزرقاء على مستوى الخلية الفردية في الوقت الفعلي.
سيوضح هذا الإجراء ديفيد هارتنيل ، طالب الدكتوراه الذي يعمل في مختبر قياس الخلايا في جامعة بورنموث. قبل بدء التجربة ، ضع أنبوب انحلال الدم فارغا على مسبار حقن العينة. انقر فوق unlog.
ثم التدفق مرة أخرى لبدء عملية تنظيف قياس التدفق الخلوي. في نهاية التدفق الخلفي ، قم بتحميل أنبوب انحلال الدم الجديد الذي يحتوي على ملليلترين من الماء المصفى فائق النقاء على مسبار حقن العينة ، أو SIP ، واضبط الحد الزمني على 10 إلى 15 دقيقة ، وسرعة السوائل على السرعة. بعد ذلك ، حدد خلية بيانات جديدة ، وقم بتعيين عتبات التألق والتشتت الخفيف ذات الصلة لتقليل ضوضاء الخلفية.
ثم انقر فوق تشغيل. إذا كان إجمالي الأحداث في الثانية لا يقل عن توصية الشركة المصنعة ، فقم بتشغيل ملليلترين من محلول إزالة التلوث لمدة دقيقتين بسرعة. وكرر خطوات تدفق الظهر وتنظيف المياه فائقة النقاء.
لتحضير الزراعة الأحادية الأولية M.aeruginosa ، قم بالأوتوكلاف 98 مل من الماء المصفى فائق النقاء ، ممزوجا بملليلترين من وسط الطحالب ، في دورق سعة 250 مليلتر لمدة 20 دقيقة عند 120 درجة مئوية. عندما تكون الثقافة في حالة عالية من الكثافة المستقرة ، قم بتقسيم ملليلترين من الخلايا عن طريق الدوامة. ثم نقل الخلايا تحت مسبار حقن العينة.
تأكد من أن الخلايا مشتتة بالتساوي عن طريق الفحص المجهري الضوئي. ثم حدد مخطط الرسم البياني على برنامج مقياس التدفق الخلوي لتسجيل بيانات مبعثر الضوء الأمامي. وانقر فوق السجل لعرض البيانات في مقياس سجل على المحور السيني.
في إخراج منفصل ، قم بتعيين رسم بياني آخر لمحور السجل لتسجيل التألق الطبيعي لخلايا M.aeruginosa. بعد ذلك ، حدد مصدر ضوء يمكنه إثارة الفيكوسيانين ، وكاشف يمكنه تصفية الانبعاثات من التألق الناتج. للتسجيل بأعلى دقة، حدد الإعدادات الأقرب إلى الحجم الأساسي للكائن الحي المستهدف.
وتعيين معدل تدفق بطيء نسبيا. قبل الحصول على البيانات ، قم بتعيين عتبة لإخراج أي إشارات تشتت ضوئية ومضان ناتجة عن ضوضاء الخلفية الإلكترونية أو حطام عينة الخلية. ثم حدد خلية بيانات جديدة.
قم بإنشاء مخطط كثافة باستخدام معلمات مبعثرة أمامية وجانبية على مقياس سجل، وانقر فوق تشغيل. الآن قم بتطبيق تشتت الضوء الأمامي وبوابة التألق الطبيعية على بيانات التشتت الأمامية جنبا إلى جنب لاستبعاد أي إشارات تشتت منخفضة المستوى ، ولتضمين إشارات فيكوسيانين الفلورية النسبية الأعلى فقط. ثم اجمع الأحداث حتى تنتهي العينة، واستخدم البيانات لتحديد عدد الخلايا الأولي.
لتحسين امتصاص خلية المسبار الجزيئي ، قم بتعريض نصف الزراعة الأحادية المعدة مسبقا للظروف المناسبة لتوليد تحكم ميت. تحقق من الاختلافات في البيئة الدقيقة للعينة لتأكيد موت الثقافة. ثم قم بتقسيم تكوين المستعمرة كما هو موضح للتو.
بعد ذلك ، حدد ليزر 488 نانومتر جنبا إلى جنب مع كاشف يمكنه تسجيل التألق من مجسات الحمض النووي الأخضر والبرتقالي. والليزر 640 نانومتر لتسجيل إشارات الفيكوسيانين من خلال أجهزة الكشف الخاصة بها. في ورقة بيانات جديدة، قم بإعداد مخطط كثافة مع معلمات التشتت الأمامية والجانبية.
ثم قم بإنشاء رسم بياني واحد باستخدام قناة الكاشف البصري للمسبار الجزيئي المعني. رسم بياني واحد للكشف عن انبعاثات الفيكوسيانين ، ورسم بياني واحد لأحداث التشتت الأمامي ، كل ذلك على مقياس لوغاريتمي. قم بتشغيل عينات البكتيريا الزرقاء باستخدام تركيزات وأوقات حضانة مختلفة.
قم بإنشاء بوابة في الرسم البياني للتبعثر الأمامي لتضمين الأحداث فقط مع حجم خلية الكائن الهدف. وقم بتطبيقه على قناة مسبار التألق المقابلة. بعد ذلك ، في قناة مسبار التألق ، قم بإنشاء بوابة برمجية شاملة أخرى مقابل أعلى قمة في الرسم البياني.
وبعد ذلك قم ببوابة مضان المسبار الموجب المقابل على مخطط الكثافة. قارن عدد إشارات التألق بعدد خلايا التحكم الميتة ، حيث تكون أعلى نسبة من امتصاص المسبار النووي للخلية لا ينتج عنه تلطيخ غير محدد. لاختبار تداخل التداخل الفلوري من تلطيخ الخلايا الجوهري أو غير المحدد ، حدد بيانات الثقافة المختلطة الحية و 50 في المائة الميتة بنسبة 50 في المائة.
وإزالة بوابات الفلورسنت. قم بتطبيق البوابات لتشمل فقط الرسم البياني للمبعثر الأمامي لحجم خلية الكائن الحي المستهدف على الرسم البياني لقناة فيكوسيانين. بوابات أعلى وأدنى قمم فيكوسيانين ، وتصنيفها على قيد الحياة والميتة ، على التوالي.
ثم قم بتطبيق البوابات بشكل منفصل على إشارات الفيكوسياانين الحية والميتة. وسجل كلا المتوسطين من الأطوال الموجية. لتحديد حساسية البروتوكول ، قم بمقارنة متوسط الأطوال الموجية للتألق الجزيئي الميت الموجب ، والإشارة الحية الجوهرية غير المحددة.
أخيرا ، حدد البروتوكول المحسن حيث تم تلطيخ أكبر كمية من الخلايا الميتة دون حدوث تلطيخ غير محدد. في هذه الرسوم البيانية ، يتم عرض مخرجات تشتت الضوء الأمامي والجانبي التمثيلي ، للحجم الخلوي والتعقيد الداخلي لثقافة دفعة M.aeruginosa في المرحلة الأسية. يمكن إجراء البوابات عن طريق تحسين البيانات بين نقاط معينة من إخراج مبعثر الضوء الأمامي.
ينتج فيكوسيانين إشارة قوية عند استجوابه بواسطة مصدر ضوء أحمر ، والذي يمكن استخدامه لزيادة بوابات السكان المهتمين. من إشارات تشتت الضوء الأمامي والفلورسنت ، يمكن بعد ذلك بوابات البيانات من الإخراج الأصلي ، إلى بيانات محددة على عينة M.aeruginosa لتعداد الخلايا النهائي. عندما يتم خلط عناصر التحكم الحية ذات الصبغة العالية والميتة ذات الصبغة المنخفضة ، يصبح التحول المتناقص في التألق التلقائي واضحا.
في الخلايا المعرضة للخطر بالغشاء ، تنتج مجسات الحمض النووي إشارة إضافية يمكن ملاحظتها عن طريق قياس التدفق الخلوي وتأكيدها بشكل أكبر عن طريق الفحص المجهري اللامع الفلوري. يزداد تمييز التألق بين الخلايا الحية والميتة بمرور الوقت بين تركيزات 0.05 و 0.5 ميكرومولار ، ولكنه ينخفض بين تركيزات واحد و 100 ميكرومولار لكلا المجسات. في الواقع ، يبدو أن التركيز الأمثل لمسبار الحمض النووي الأخضر هو 0.5 ميكرومولار مع وقت حضانة يبلغ 30 دقيقة.
بالنسبة لمسبار الحمض النووي البرتقالي ، يكون التركيز الأمثل هو ميكرومولار واحد لمدة 10 دقائق. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال التحسين لكل مسبار جزيئي في يوم واحد ، إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إبقاء المجسات في بيئة مستقرة ، تحت درجة الحرارة المناسبة ، ودرجة الحموضة ، وظروف الضوء.
بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة لاستكشاف عدم تجانس المجتمع في العوالق النباتية. بعد مشاهدة الفيديو ، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية تطوير بروتوكول مثالي لتقييم علم وظائف الأعضاء الخلوي باستخدام قياس التدفق الخلوي والمجسات الجزيئية. لا تنس أن العمل مع المجسات الجزيئية والكائنات السامة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وأن الاحتياطات مثل ارتداء PPE المناسب ، والفهم الكامل لمواد COSHH ، يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً لتحليل الحالات الفسيولوجية للبكتيريا الزرقاء باستخدام قياس انسيابية الخلايا والمجسات الجزيئية. يهدف الأسلوب إلى تحديد معدل وفيات الخلايا بدقة ضمن التجمعات الميكروبية، لمعالجة التحديات في تغايرو الخلايا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأحياء الدقيقة
- بيولوجيا الخلية
- قياس انسيابية الخلايا
الخلفية
- تظهر التجمعات الميكروبية تغايرو كبير في الخلايا.
- يمكن لقياس انسيابية الخلايا تقييم الحالات الفسيولوجية ولكنها تختلف باختلاف الأنواع.
- القياس الدقيق لمعدل وفيات الخلايا أمر بالغ الأهمية لفهم المجتمعات الميكروبية.
- يمكن للمجسات الفلورية المحسنة تعزيز التحليل على مستوى الخلية الفردية.
هدف الدراسة
- تطوير بروتوكول موثوق لتقييم فسيولوجيا البكتيريا الزرقاء.
- تحسين دقة تحديد معدل وفيات الخلايا.
- تسهيل التحليل في الوقت الحقيقي للحالات الفسيولوجية في البكتيريا الزرقاء.
الأساليب المستخدمة
- قياس انسيابية الخلايا لتحليل الخلايا.
- المجسات الجزيئية لتمييز الحالات الفسيولوجية.
- تحسين البروتوكول لنتائج دقيقة.
- البرهان من قِبل طالب دكتوراه في مختبر القياس الانسيابي.
النتائج الرئيسية
- يفرق البروتوكول بشكل فعال بين الحالات الفسيولوجية في البكتيريا الزرقاء.
- تحقق تحديد دقيق لمعدل وفيات الخلايا.
- قدم التحليل في الوقت الحقيقي رؤى حول سلوك الميكروبات.
- تدعم النتائج فهم التجمعات البكتيرية الزرقاء.
الاستنتاجات
- يعزز البروتوكول المطور تحليل فسيولوجيا البكتيريا الزرقاء.
- يعالج القيود السابقة في قياس معدل وفيات الخلايا.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة في دراسات ميكروبية مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Accurate assessment of cellular viability in microbial systems supports early-stage target validation by enabling reliable phenotypic screening and mechanistic de-risking. Flow cytometry with optimized molecular probes provides quantitative, single-cell resolution data that improves predictive confidence in lead identification campaigns. This approach addresses heterogeneity challenges in discovery biology, facilitating data-driven go/no-go decisions and reducing late-stage biological risk in antimicrobial or anti-infective pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing viable from non-viable cells in microbial populations.
- Operational Value: Supports functional target validation through membrane integrity assessment using SYTOX Green and SYTOX Orange probes.
- Predictive Value: Optimized probe concentrations (0.5 µM green, 1.0 µM orange) minimize false negatives and non-specific staining, enhancing assay reliability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible fluorescence readouts for high-throughput compound screening in antimicrobial discovery.
- Quantitative Output: Enables precise measurement of probe uptake as a dependent variable for dose-response modeling.
- Scalability: Protocol optimization in Microcystis aeruginosa provides a transferable framework for other cyanobacterial or microbial systems.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports preclinical modeling of antimicrobial efficacy by quantifying compound-induced mortality in target pathogens.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase viability screening to preclinical validation through consistent, flow cytometry-based endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in lead optimization by providing real-time, single-cell physiological data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights that inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by correlating compound treatment with changes in cellular viability.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducibility through optimized probe incubation and concentration parameters.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence measurements enabling statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking membrane integrity readouts to compound mechanism of action.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cytometry platform applicable across microbial targets in anti-infective programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false viability readings through probe optimization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories via defined probe concentrations and incubation times.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of compounds lacking target-specific activity.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds with genuine antimicrobial effects versus assay artifacts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry operation and fluorescence compensation for multi-parameter detection.
- Dependent on access to flow cytometers with 488 nm laser compatibility and appropriate detection channels for SYTOX dyes.
- Necessitates cross-team protocol standardization to ensure consistent probe handling, storage, and application.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to Gram-positive or Gram-negative bacterial models.
- Includes practical limitations such as probe toxicity and the need for biosafety containment when working with toxic organisms like Microcystis aeruginosa.
