تميز ميكروبيومي ديناميات – التدفق الخلوي على أساس مهام سير العمل من ثقافات نقية للمجتمعات الطبيعية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم البيئة الميكروبية والتكنولوجيا الحيوية ، على سبيل المثال ، المفاهيم البيئية التي تقود أي نظام بيئي معين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لإغلاق ديناميكيات الميكروبيوم السريعة التالية مع نظام أخذ العينات بفاصل قصير مع الحفاظ على فعالية عالية من حيث التكلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة للحصول على معلومات عن التكنولوجيا الحيوية والمجتمعات الميكروبية الطبيعية وأيضا عن الميكروبيوم الحيواني والبشري للحالات الغذائية والصحية.

توضيح الإجراء فلوريان شاتنبرغ ، فني ومشغل SediMeter في مختبرنا. لتجفيف عينة مجتمع الغاز الحيوي، استخدم طرف ماصة معدل سعة مليلتر واحد لنقل 200 ميكرولتر من مادة الهضم اللزجة إلى أنبوب سعة ملليلترين يحتوي على 1.7 ملليلتر من PBS. بعد الخلط الشامل ، ضع الأنابيب في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة دقيقة واحدة لتفكيك أي مجاميع خلوية كبيرة وإرفاق الخلايا الملتصقة ببقايا الخلايا النباتية.

بعد الصوتنة ، امزج العينة جيدا وقم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة شبكية مسام 50 ميكرومتر في أنبوب بلاستيكي سعة 2 مل. قسم المرشح إلى أربعة 400 ميكرولتر من الحصص وقم بالطرد المركزي للحصص مرتين ، وتخلص من المادة الطافية تماما في المرتين لإزالة الماء ميكانيكيا من عينة الميكروب بأكبر قدر ممكن من الدقة. ثم جفف العينة في جهاز طرد مركزي مفرغ ساخن لإنشاء حبيبات مستقرة وتخزين الحبيبات عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء.

لتثبيت عينات الحمأة المنشطة وتثبيتها ، قم بالطرد المركزي أربعة ملليلتر من الخلايا وأعد تعليق الحبيبات في أربعة ملليلتر من الفورمالديهايد بنسبة اثنين في المائة في PBS. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بالطرد المركزي لعينة الخلية المستقرة وقم بإصلاح الحبيبات في أربعة ملليلتر من 70٪ من الإيثانول لتخزين 20 درجة مئوية تحت الصفر. امزج وانقل 0.6 مل من تعليق الخلية الثابتة إلى أنبوب زجاجي يحتوي على 1.4 مل من PBS وبعد الخلط الشامل ، قم بالصوتنة لمدة 10 دقائق كما هو موضح.

في نهاية الصوتنة ، قم بجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من PBS الطازجة. بعد الخلط الشامل ، قم بصوتنة الخلايا كما هو موضح للتو لمدة خمس دقائق واضبط OD 700 نانومتر إلى 035 باستخدام PBS الطازج. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للنفاذية الذي يحتوي على 0.11 حامض الستريك المولي ، و 4.1 مللي مولار 20 ، مع خلط شامل ، لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات تماما في ملليلتر من محلول التلوين الذي يحتوي على 0.68 ميكرومولار DAPI ، لمدة 60 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. لمعايرة الخرزة ، قم بتحميل مزيج الخرزة للمعايرة الخطية في مقياس التدفق الخلوي ، وقم بقياس الخرزات بشكل مستمر أثناء معالجة مواضع الفوهة وبصريات الليزر لمعايرة الجهاز مسبقا في النطاق الخطي. عندما يمكن احتواء قمم الخرزة في قالب معايرة محدد مسبقا ، قم بالتبديل إلى وضع السجل ، وقم بتحميل عينة حبة معايرة لوغاريتمية.

قم بتركيب قمم الخرزة اللوغاريتمية مع قالب المعايرة المحدد مسبقا لضبط أجهزة الجهاز ، واستخدم إعداد كسب أنبوب المضاعف الضوئي لإجراء أي تعديلات نهائية ضرورية على موضع الخرزة يتمثل الجانب الأكثر أهمية في هذا الإجراء في الحفاظ على قياسات متسقة للسماح بالمقارنة بين التجارب. لذلك ، فإن المعايرة اليومية لمقياس الخلايا واستخدام الخرز في أغطية الجذع البيولوجية أمران حيويان لنجاح غسيل الكلى الميكروبيوم السيترومي البطيء. عندما تصبح الخلايا جاهزة ، قم بخلط العينات وترشيحها وإضافة مزيج الخرزة اللوغاريتمي إلى الخلايا.

الآن امزج العينة وقم بتحميلها على مقياس الخلوي وقم بإنشاء بوابة لتشمل الخلايا الملطخة واستبعاد الضوضاء والخرز. ثم قم بتحليل عينة المجموعة على التوالي بسرعة قصوى تبلغ 3,000 حدث في الثانية حتى يتم اكتشاف 250,000 خلية داخل بوابة الخلية. لتحليل بيانات قياس التدفق الخلوي ، قم بتطوير قالب بوابة رئيسية لاستخدامه في جميع العينات.

ابدأ بتحميل الملفات القياسية لقياس التدفق الخلوي في برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي المناسب ومعالجة العينات على التوالي. قم بتحميل العينات، وانقر نقرا مزدوجا فوق القياس وحدد معلمات المحور X وY، من القوائم المنسدلة الخاصة بهما لفتح مخطط مبعثر أمامي مقابل مخطط مضان DAPI. استخدم أداة رسم المضلع لإعادة إنتاج بوابة خلية القياس التي تم إنشاؤها مسبقا لاستبعاد الخرزات والضوضاء ، وتسمية البوابة وفقا لذلك.

اسحب إدخال بوابة الخلية إلى قائمة مجموعة جميع العينات، وانقر نقرا مزدوجا فوق بوابة الخلية لعرض أحداث الخلية فقط بشكل انتقائي. حدد المجتمعات الفرعية السائدة في عينة باستخدام أداة البوابة الإهليلجية، وقم بتجميعها. ثم أضف تخصيصات إضافية للمجتمع الفرعي والعينات اللاحقة حتى يناسب قالب البوابة الرئيسية جميع العينات.

تحكم في قالب البوابة الرئيسية باستخدام طريقة مسح التبعثر الجانبي لحل مجموعات المجتمعات الفرعية بالقرب من بعضها البعض. بعد ذلك ، أضف جميع المجتمعات الفرعية إلى محرر الجدول ، واضبط إحصائية الإخراج على تكرار الأصل. استخدم محرر الجدول لتصدير الوفرة النسبية للمجتمع الفرعي إلى برنامج جداول بيانات مناسب، وتكييف تنسيق البيانات وفقا للإرشادات الواردة في دليل الشريط الجانبي.

بعد ذلك، لتصور ديناميكيات المجتمع الفرعي والارتباطات، قم بتثبيت حزمة R وتحميلها، وتحميل ملف txt وتطبيعه. تكشف مخططات التشتت الأمامية مقابل مخططات مضان DAPI عن حالات دورة الخلية لمزارع السلالة النقية في نقاط مختلفة في ثقافة الدفعات. يسمح استخدام قالب البوابة الرئيسية بعد ذلك بالقياس الكمي لنسبة الخلايا التي تحتوي على كروموسومات واحدة أو اثنين أو عدة كروموسومات ، مما يكشف ، على سبيل المثال ، عن قدرة هذا الميكروب التمثيلي على تكرار كروموسوماته بشكل أسرع من وقت توليده.

عند التحقيق في المجتمعات الميكروبية المعقدة بمرور الوقت ، يمكن تصور وتيرة وأهمية تحول المجتمع بسهولة من خلال تسلسل مخطط النقاط. يمكن تحديد المجتمعات الفرعية المهيمنة في مراحل مختلفة من التجربة بوضوح باستخدام أداة الرمز الشريطي الخلوي. يسمح الجمع بين هذه البيانات مع توزيع التردد للوفرة النسبية للمجتمع الفرعي باختيار البوابات التي تدل على تغيرات كبيرة في الوفرة في النقاط الزمنية الرئيسية.

يمكن أن يسهل تصور هذه البيانات في مخطط قياس متعدد الأبعاد غير متري فهما أعمق لديناميكيات المجتمع. يمكن أن تواجه مجتمعات الغاز الحيوي عدم تجانس مكاني بسبب قيود التحريض. تظهر نقاط عينة مجتمع الغاز الحيوي النموذجية القليل من عدم التجانس المكاني ، ولكن الواضح

يمكن أن تساعد الارتباطات الإيجابية أو السلبية القوية مع المعلمات اللاأحيائية مثل تشديد المنتج في فهم وتحسين النظم البيئية وعمليات التكنولوجيا الحيوية. علاوة على ذلك ، فهي تيسر تحديد البوابات ذات الأهمية الخاصة للفرز والتحليل اللاحقين. أثناء إنشاء هذا الإجراء ، ينصح بتقييم إجراءات التثبيت والتلوين المختلفة لتقييم أدائها واستقرارها لكل مجموعة عينات جديدة.

بعد الفرز ، يمكن تطبيق المزيد من الأساليب مثل السياج الضخم ، وعلم الميتاجينوميات ، والبروتينات لتحديد أفضل المجتمعات التي تعطي معلومات عن الانتماء الجيني الأولي على حالات النشاط خارج مسارات التمثيل الغذائي. مهدت هذه الطريقة الطريق لعلماء البيئة الميكروبية ومهندسي العمليات الحيوية لمتابعة ديناميكيات الميكروبيوم والنظم البيئية الطبيعية والخاضعة للرقابة باستثمار معقول للموارد.