الآلي وحدات إنتاجية عالية Exopolysaccharide فحص منصة مقرونا حساسة للغاية تحليل الكربوهيدرات بصمات الأصابع

الهدف العام من هذا النهج هو الفحص السريع والموثوق لمنتجي عديد السكاريد الميكروبي وتحديد بصمات الكربوهيدرات الخاصة بهم. هذه خطوة أساسية من أجل الاستفادة من التنوع غير المستكشف لعديدات السكاريد الخارجية. يمكن أن تساعد طريقتنا في تسريع أبحاث البوليمر في مجال عديد السكاريد الميكروبي الميكروبي.

إنه يتيح التعرف السريع على متغيرات عديد السكاريد الجديدة ذات الخصائص المختلفة لتطبيقات محددة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الجمع بين أنظمة الكشف عن عديد السكاريد الخارجي المختلفة في مفهوم فحص معياري ومؤتمت بالكامل. هذا يجعلها سريعة وموثوقة للغاية.

يمكن أيضا إجراء هذه التقنية يدويا في المختبرات التي لا تتوفر فيها منصة أتمتة ، وبالتالي فإن استخدامها مرن للغاية ، ويمكن تعديله وفقا لاحتياجات الفحص المختلفة. تحتوي منصة فحص عديدات السكاريد الخارجية هذه ، أو EPS ، على إعداد معياري ، مما يسمح بفصل البروتوكول إلى جزأين رئيسيين ، الفحص الآلي وبصمة الكربوهيدرات. المهمة الأولى هي زراعة السلالات لفحص الخلايا وإزالتها عن طريق الطرد المركزي.

يتم زراعة السلالات على الجلوكوز كمصدر للكربون في ألواح 96 بئرا مغطاة بغشاء مانع للتسرب قابل للتنفس على شاكر لوحة العيار الصغير عند 30 درجة مئوية و 1 ، 000 دورة في الدقيقة. في يوم الشاشة ، قم بإعداد طاولة عمل الروبوت ودائرة التخزين كما هو موضح في نص البروتوكول. قم بإزالة فيلم الختم القابل للتنفس من الألواح وقم بتخصيص الثقافات الرئيسية في مواضع دائرية من 1-1 إلى 1-4.

ابدأ البرنامج الآلي الآلي. لإزالة الخلايا بعد الزراعة ، انقل ألواح الآبار العميقة للثقافة الرئيسية من الرف الدائري إلى جهاز الطرد المركزي ، وأجهزة الطرد المركزي عند 4 ، 300 × جم و 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بالنسبة لهطول الأمطار قبل الترشيح ، انقل ألواح العيار الصغير ، بالإضافة إلى ألواح العيار الصغير ذات مؤشر الأس الهيدروجيني ، من الرف الدائري إلى طاولة العمل.

انقل أيضا ألواح الترشيح ، والتي تضمن الإزالة الكاملة لجميع الخلايا البكتيرية ، جنبا إلى جنب مع ألواح التجميع إلى مواضع منضدة العمل الخاصة بها. بعد الطرد المركزي ، انقل 180 ميكرولترا من المادة الطافية الرئيسية إلى لوحة الترشيح. استنشق 150 ميكرولترا من المادة الطافية للثقافة الرئيسية وقم بتوزيع 50 ميكرولترا في لوحة العيار الصغير لهطول الأمطار قبل الترشيح ، و 100 ميكرولتر إلى لوحة مؤشر الأس الهيدروجيني.

يتم إجراء ترسيب المادة الطافية مع 2-بروبانول لتقييم إنتاج EPS. استخدم ماصة متعددة الخطوات سعة 12.5 مليلتر لإضافة 150 ميكرولتر من 2-بروبانول يدويا إلى كل بئر. بعد هز ألواح العيار الصغير في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 900 دورة في الدقيقة ، راقب بصريا تكوينات الألياف أو التقشر التي تشير إلى إنتاج EPS.

بعد تخزين ألواح الاستزراع الرئيسية مرة أخرى في الرف الدائري ، افحص مرق التخمير ، والذي يجب أن يظهر انخفاضا في الترسيب بعد الطرد المركزي. الزيادة في اللزوجة هي مؤشر آخر على إنتاج EPS. المهمة الثانية هي ضمان الإزالة الكاملة للخلايا من مرق التخمير اللزج عبر ترشيح 96 بئرا.

بالطرد المركزي لألواح الترشيح عند 3 ، 000 × جم و 20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم أعد الألواح إلى موضعها المنزلي الدائري وقم بإجراء موازنة الترشيح الهلامي كما هو موضح في نص البروتوكول. بعد ذلك، قم بنقل الماصة 35 ميكرولترا من الترشيح إلى مركز لوحة الترشيح الهلامية المتوازنة، و50 ميكرولترا إلى لوحة المعايرة الدقيقة المستخدمة في هطول الأمطار.

انقل ألواح الترشيح الهلامية إلى جهاز الطرد المركزي ، وانقل جميع الألواح الأخرى من طاولة العمل إلى مواضع المنزل في الرف الدائري. بعد تخزين جميع الألواح مرة أخرى في الرف الدائري ، لاحظ المواد الطافية عالية اللزوجة كما هو موضح في البقايا الموجودة في لوحة المرشح. يمكن أن يؤدي نقص الترشيح إلى نتائج سلبية خاطئة في الوحدات التحليلية التالية.

المهمة الثالثة في الفحص الآلي هي إزالة السكريات الأحادية المتبقية من وسط النمو عبر ترشيح هلام 96 بئرا. الطرد المركزي لألواح ترشيح الجل عند 1،000 × جم و 20 درجة مئوية لمدة دقيقتين. قم بإعداد طاولة العمل عبر المناور الآلي لمعالجة مرشحات الجل.

للكشف عن الجلوكوز المتبقي بعد ترشيح الهلام، لدينا نصائح سعة 50 ميكرولتر لنقل 25 ميكرولترا من الماء المقطر بشكل مضاعف إلى صفيحة عيار دقيقة جديدة. استنشق 20 ميكرولترا من الماء المقطر بشكل مضاعف ، وخمسة ميكرولترات من الهواء ، و 5 ميكرولترات من ترشيح الهلام ، واستغني عنها في نفس اللوحة. خذ أطراف سعة 200 ميكرولتر واستنشق 50 ميكرولترا من مزيج كاشف فحص الجلوكوز من موضع المنضدة 1-2 لبدء الفحص الأول.

انقل ألواح العيار الدقيقة إلى الحاضنة. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، انقل الألواح من الحاضنة إلى قارئ العيار الصغير ، وسجل الامتصاص عند 418 و 480 نانومتر. لتحديد محتوى الكربوهيدرات الكلي بطريقة حمض الفينول والكبريتيك ، قم بتمرير الماصة 20 ميكرولترا من ترشيح الهلام إلى ألواح العيار الدقيق.

قم بإزالة الألواح يدويا من الرف الدائري وضعها في محطة معالجة السوائل. قم بتضمين لوحة المعايرة التي تحتوي على 20 ميكرولترا من تركيزات الجلوكوز المختلفة في ثلاث نسخ. ضع حاوية نفايات في الموضع 1 ، وصندوق طرف سعة 300 ميكرولتر في الموضع 2 ، وحوض 250 مليلتر مع 110 مل من حمض الفينول الكبريتيك المحضر حديثا في الموضع 3.

استخدم ماصة ذات 8 قنوات بأطراف سعة 300 ميكرولتر لنقل 180 ميكرولتر من حمض الفينول الكبريتيك إلى كل صف من جميع الألواح. قم بتغطية جميع ألواح المعايرة الدقيقة بأغطية واخلطها عن طريق رجها لمدة خمس دقائق عند 900 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. احتضن لمدة 35 دقيقة عند 80 درجة مئوية في فرن لتفاعل اللون.

بعد تبريد الصفائح تحت غطاء الدخان ، قم بقياس الانقراض عند 480 نانومتر. يتم تصنيف السلالات من الفحص الآلي على أنها إيجابية EPS إذا استوفت اثنين على الأقل من المعايير الثلاثة التالية. التحكم في اللزوجة ، والكشف عن البوليمر ، ومكافئ الجلوكوز المحسوب.

يتم حساب مكافئ الجلوكوز باستخدام هذه المعادلة. تحتوي بصمة الكربوهيدرات لمنصة الفحص على المهام الثلاث الأخيرة التي يتم تنفيذها يدويا. يوفر المرشح المتبقي من الضربات الإيجابية من المهمة الثانية الأساس لترشيح الهلام في المهمة الخامسة.

المهمة السادسة هي انحلال الرطوبة الدقيق المكون من 96 بئرا لمرشح الهلام. لتحقيق ذلك، استخدم أولا ماصة سعة 50 ميكرولتر ذات 12 قناة لنقل 20 ميكرولترا من الترشيح الهلامي إلى لوحة PCR جديدة. ثم استخدم ماصة متعددة الخطوات سعة 1.25 ملليلتر لإضافة 20 ميكرولترا من أربعة حمض ثلاثي فلورو أسيتيك مولار إلى كل بئر.

قم بتغطية لوحة PCR بحصيرة غطاء مطاطية بالحرارة ، وضع لوحة PCR في جهاز تثبيت خاص. امزج المحاليل عن طريق قلب جهاز التثبيت 10 مرات. بعد الطرد المركزي للوحة PCR ، وتثبيتها في جهاز التثبيت ، ضع جهاز التثبيت الآمن في حمام رملي مسخن مسبقا واحتضانه عند 121 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.

باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ذات 12 قناة ، أضف محلول أمونيا بنسبة 3.2٪ لضبط الأس الهيدروجيني إلى ثمانية تقريبا. قم بتغطية لوحة PCR بحصيرة غطاء مطاطية بالحرارة ، وقم بهزها يدويا باستخدام جهاز التثبيت. تتمثل المهمة الأخيرة في تحليل بصمة الكربوهيدرات عبر طريقة 1-فينيل-3-ميثيل-5-بيرازولون عالية الإنتاجية أو HTPMP.

لبدء هذا الإجراء، استخدم ماصة سعة 50 ميكرولترا ذات 12 قناة لنقل 25 ميكرولترا من التحلل المائي المحايد إلى لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديدة. أضف 75 ميكرولترا من مزيج كاشف الاشتقاق وقم بتغطية اللوحة بساط غطاء مطاطي حراري. ضع لوحة PCR في جهاز تدوير PCR على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 100 دقيقة ، متبوعا بالتبريد إلى 20 درجة مئوية.

انقل كمية كبيرة سعة 20 ميكرولترا إلى لوحة عيار دقيقة جديدة، ثم استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر ذات 12 قناة لإضافة 130 ميكرولتر من حمض الخليك 19.23 مللي مولار إلى كل سطر. امزج مباشرة عن طريق الشفط والتوزيع ست مرات على الأقل ، وانقل كل السائل إلى لوحة ترشيح 0.2 ميكرومتر مع لوحة تجميع عيار دقيقة. قم بالطرد المركزي للوحة عند 1 ، 000 × جم لمدة خمس دقائق ، وقم بإزالة لوحة المرشح ، وأغلق لوحة تجميع العيار الصغير بحصيرة غطاء سيليكون.

ضع لوحة العيار الدقيقة في UHPLC-UV-ESI-MS لتحديد بصمة الكربوهيدرات. يوضح هذا الجدول نتائج ثلاث سلالات جديدة نموذجية كما تم تحديدها بنجاح مع منصة الفحص هذه. يعرض الجزء الأيسر من الجدول نتائج وحدات الفحص الآلي المتعلقة بتكوين اللزوجة وإنتاج البوليمر ومكافئ الجلوكوز من التحلل المائي الكلي ، والتي تم استخدامها كمعلمات تقييم لتحليل بصمات الكربوهيدرات التفصيلية.

إعطاء بصمة الكربوهيدرات على أساس السكريات المعايرة بالإضافة إلى السكريات غير المعروفة وثنائيات وبدائل في الجزء الأيمن من الجدول. باستخدام هذه المعلومات ، يمكن حساب التركيب الأحادي ومقارنته بهياكل البوليمر المعروفة بالفعل. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء فحص مستهدف للتركيبات الأحادية المثيرة للاهتمام والكربوهيدرات النادرة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية ل 386 سلالة في غضون خمس ساعات فقط. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تضمين فحوصات إضافية مثل البيروفات الموجود بالفعل أو فحوصات أخرى للأسيتات أو الفوسفات من أجل الإجابة على سؤال إضافي عن إعلان عديد السكاريد الخارجي. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية ، من خلال حساسيتها العالية ، الطريق لأبحاثنا في مجال منتجي عديد السكاريد الميكروبي المهندسين الوراثيين لاستكشاف تأثير مسارات التخليق الحيوي عديد السكاريد الخارجية المتغيرة على التركيب الكيميائي القائم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعرف على منتجي عديد السكاريد الخارجي الجدد بطريقة سريعة وموثوقة للغاية.