التنميط التعبير الجيني اصابة الميكروبات باستخدام منصة رقمية من الترميز

الهدف العام من هذه التجربة هو قياس التعبير الجيني لمسببات الأمراض بدقة داخل الجسم الحي (in vivo)، وذلك لتسليط الضوء على كيفية تكيف مسبب المرض مع البيئة المعدية وتسببه في إلحاق الضرر بالمضيف. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأمراض المعدية لاستكشاف ديناميكيات التعبير الجيني لمسببات الأمراض أثناء العدوى الحقيقية في أنواع مختلفة من الأنسجة وفي نقاط زمنية متعددة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في كونها عالية الحساسية وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة.

تتيح هذه الطريقة إمكانية قياس التعبير الجيني لمسببات الأمراض من كميات ضئيلة من الأنسجة المأخوذة من عدوى واقعية. لبدء تحضير الكواشف، أضف 2-Mercaptoethanol إلى buffer RLT وامزجه جيداً. قم بتحضير مزيج من محلول phenol-chloroform isoamyl alcohol بنسبة 25:24:1.

قم بتسمية أنابيب التجانس من النوع M وتبريدها على الثلج. قم بتسمية أنابيب ذات غطاء لولبي سعة 2 مل وأضف حوالي 300 µL من حبيبات الزركونيا إلى كل أنبوب. جهز الأدوات التالية للاستخدام، بما في ذلك جهاز تفكيك الأنسجة، وجهاز طحن بالخرز (bead beater)، وجهاز طرد مركزي مكتبي مزود بمهايئات لأنابيب سعة 50 مل وأطباق ذات 96 بئراً، ومقياس ضوئي (photometer).

أخرج الكلى التي سبق تجميدها والمعزولة من الفئران المصابة بـ C.albicans من مجمد درجة حرارته 80 درجة celsius وضعها على الثلج. أضف 1.2 milliliters من المحلول المنظم RLT إلى كل كلية. بعد ذلك، صب كل كلية مع المحلول المنظم في أنبوب تجانس من النوع M.

يتم تحديد كمية منظم RLT المستخدمة تجريبياً. حيث يؤدي استخدام كمية كبيرة جداً من منظم RLT إلى تخفيف تركيز العينة، بينما تؤدي الكمية القليلة جداً إلى جعل المتجانس لزجاً للغاية وصعب التعامل معه بشكل كبير. بعد ذلك، وباستخدام جهاز تفكيك الأنسجة على الإعداد المسبق RNA 2.01، يتم تجنيس الكلى.

بعد ذلك، يتم إجراء الطرد المركزي عند 1000 x G لمدة دقيقة واحدة. تُنقل 600 µL من كل مستحلب إلى أنبوب ذي غطاء لولبي يحتوي على حبيبات الزركونيا، ويُحفظ المتبقي من المستحلب على الثلج. يُضاف 600 µL من الفينول-كلوروفورم وكحول الإيزوأميل إلى كل أنبوب، وتُغلق الأغطية بإحكام، ثم يتم الرج باستخدام جهاز vortex على جهاز طحن الخرز (bead beater) لمدة ثلاث دقائق عند 4 °C.

قم بالطرد المركزي بسرعة 15,000 G لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. انقل الطور المائي بعناية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 mL، مع إضافة حجم مساوٍ من الإيثانول بتركيز 70%. بعد ذلك، قم بالتحميل على عمود الدوران (spin column) ثم قم بالتدوير بسرعة 8,000 x G. اغسل كل عمود دوران مرة واحدة باستخدام 700 µL من المنظم RW، يليه غسلتان باستخدام 500 µL من المنظم RPE.

انقل الأعمدة إلى أنابيب تجميع جافة وقم بالطرد المركزي لمدة دقيقة إضافية لإزالة أي سائل متبقٍ. وأخيراً، استخدم 50 µL من الماء لاسترداد الـ RNA. ثم استخدم جهاز مطياف الامتصاصية عند طول موجي 216 nm لقياس تركيز الـ RNA.

لإجراء تحليل نمط التعبير الجيني باستخدام الترميز الشريطي الرقمي، ابدأ بإذابة مجموعة رموز المراسل ومجموعة رموز الالتقاط على الثلج. أضف 130 µL من محلول التوطيد (hybridization buffer) إلى مجموعة رموز المراسل. اقلب الأنبوب للمزج ثم استخدم جهاز الطرد المركزي لترسيب السائل.

أضف بعد ذلك 20 µL من المزيج إلى كل أنبوب من أنابيب التفاعل الـ 12. ثم أضف 10 µg من RNA الكلي للأنسجة إلى كل أنبوب واخلط عن طريق الماصة. وبناءً على نموذج العدوى، وحجم اللقاح، وسلالة الممرض المستخدمة، تختلف نسبة RNA الممرض ضمن RNA الكلي من 0 إلى 2%. لذا، يجب تحسين الكمية الكلية من RNA المطلوب إضافتها لكل عينة تجريبياً.

الآن، أضف 5 µL من مجموعة رموز الالتقاط (capture code set) إلى كل أنبوب. اخلط المحتويات عن طريق قلب الأنابيب ثم قم بعملية تدوير سريعة (spin down). بعد ذلك، قم بتحضين التفاعلات في جهاز الدورة الحرارية (thermal cycler) عند درجة حرارة 65 °C مع استخدام غطاء مسخن لمدة 18 ساعة تقريبًا.

أخرج خرطوشة عينة واحدة من درجة حرارة 20 degrees celsius واتركها لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. أخرج لوحين من الكواشف من درجة حرارة 4 degrees celsius وقم بتدويرهما في جهاز طرد مركزي مكتبي عند 670 x G لمدة دقيقتين. بعد ذلك، قم بإعداد محطة التحضير باتباع التعليمات خطوة بخطوة الظاهرة على الشاشة، مع اختيار خيار الحساسية العالية.

بعد ذلك، أخرج التفاعلات من الجهاز الدوري الحراري وحملها فوراً على محطة التحضير. بعد تشغيل برنامج الحساسية العالية لمدة ثلاث ساعات، أخرج الخرطوشة واستخدم شريطاً لاصقاً شفافاً لسد المسارات. ضع الزيت المعدني في قاع الخرطوشة إذا لزم الأمر.

بعد ذلك، قم بتركيب الخرطوشة في المحلل الرقمي. ابدأ بإعداد المحلل الرقمي باتباع التعليمات الموضحة خطوة بخطوة على الشاشة، مع اختيار خيار المسح عالي الدقة. وبعد تشغيل برنامج المسح، قم بتنزيل النتائج أو اختر استلامها عبر البريد الإلكتروني، ثم استورد البيانات الخام إلى برنامج الشركة المصنعة.

قم بتحليل البيانات وفقاً للبروتوكول النصي. يتميز البروتوكول الموضح في هذا الفيديو بميزة فريدة تتمثل في استخدامه لكل من مسبار الالتقاط ومسبار التقرير لزيادة النوعية وتقليل الضجيج الناتج عن الحمض النووي الريبي (RNA) للمضيف. وكما هو موضح هنا، كانت جميع أعداد الخلفية الخام من عينة نسيج غير مصابة أقل من 10، بينما كانت الأعداد الخام من عينتي نسيج مصابتين جميعها أعلى من 10.

أظهرت أعداد القراءات الخام من عينتين بيولوجيتين ارتباطًا جيدًا جدًا بقيمة R squared بلغت 0.945. كما توفر المنصة نطاقًا ديناميكيًا كافيًا ليشمل مستويات التعبير البيولوجي الطبيعية. وباستخدام مجموعة مجسات تحدد 248 جينًا من جينات الاستجابة البيئية، تم تحديد مرحلتين من التعبير الجيني للمسببات المرضية.

تتكون استجابة التعبير الجيني المبكرة من جينات تختلف مستويات الـ RNA فيها بشكل ملحوظ بين عينات اللقاح وعينات ما بعد العدوى بـ 12 ساعة. كما تم اكتشاف استجابة تعبير جيني متأخرة تتكون من جينات تختلف مستويات الـ RNA فيها بشكل ملحوظ بين نقطة الـ 12 ساعة وعينات ما بعد العدوى بـ 48 ساعة. وتشير هذه النتائج إلى أن التعبير الجيني لـ C.albicans يتم تنظيمه ديناميكيًا أثناء العدوى الغازية لمضيف من الثدييات.

تتميز هذه الطريقة بأنها سهلة وسريعة؛ حيث تتطلب الإجراءات بأكملها، بدءاً من جمع الأنسجة وصولاً إلى عرض البيانات، أقل من 48 ساعة. أما الوقت الفعلي للعمل فيبلغ حوالي أربع ساعات لـ 12 عينة.

بينما تم تطوير هذه الطريقة لالتقاط التعبير الجيني لمسببات الأمراض داخل الجسم الحي، يمكن استخدام الطريقة ذاتها للإجابة عن التعبير الجيني للعائل. وبناءً على ذلك، يمكن للباحثين الحصول على معلومات مفيدة من كلا جانبي العدوى في وقت واحد.