التنميط التعبير الجيني اصابة الميكروبات باستخدام منصة رقمية من الترميز

الهدف العام من هذه التجربة هو قياس التعبير الجيني لمسببات الأمراض بدقة في الجسم الحي من أجل تسليط الضوء على كيفية تكيف العامل الممرض مع البيئة المعدية والتسبب في تلف مضيفه. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأمراض المعدية لاستكشاف ديناميكيات التعبير الجيني لمسببات الأمراض أثناء الإصابة الحقيقية على أنواع مختلفة من الأنسجة وفي نقاط زمنية متعددة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها حساسة للغاية وقابلة للتكرار للغاية.

هذه الطريقة تجعل من الممكن تحديد التعبير الجيني لمسببات الأمراض من كمية صغيرة من الأنسجة من عدوى واقعية. لبدء تحضير الكواشف ، أضف 2-Mercaptoethanol لتخزين RLT واخلطه جيدا. قم بإعداد خليط 25:24: 1 من محلول كحول الفينول كلوروفورم إيزوأميل.

قم بتسمية أنابيب التجانس من النوع M وقم بتبريدها على الجليد. قم بتسمية أنبوبين من الغطاء اللولبي المليلتر وأضف ما يقرب من 300 ميكرولتر من حبات الزركونيا إلى كل أنبوب. جهز الأدوات التالية للاستخدام ، بما في ذلك جهاز تفكيك الأنسجة ، ومضرب الخرز ، وجهاز طرد مركزي منضدي مع محولات لأنابيب 50 مليلتر و 96 لوحة بئر ومقياس ضوئي.

قم بإزالة الكلى المجمدة مسبقا المعزولة من الفئران المصابة بالمطثية البيضاء من ثلاجة 80 درجة مئوية وضعها على الثلج. أضف 1.2 مل من RLT العازلة إلى كل كلية. ثم صب كل كلية مع مخزن مؤقت في أنبوب تجانس من النوع M.

يتم تحديد مقدار المخزن المؤقت RLT المستخدم تجريبيا. سيؤدي الكثير من RLT العازلة إلى تخفيف تركيز العينة بينما القليل جدا سيجعل المتجانس لزجا جدا ويصعب التعامل معه. بعد ذلك ، باستخدام مفكك الأنسجة على الإعداد المحمل مسبقا RNA 2.01 ، قم بتجانس الكلى.

ثم جهاز الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة. انقل 600 ميكرولتر من كل متجانس إلى أنبوب غطاء لولبي يحتوي على حبات زركونيا واحتفظ بالجانس المتبقي على الجليد. أضف 600 ميكرولتر من كحول إيزواميل الفينول كلوروفورم إلى كل أنبوب ، وأغلق الأغطية بإحكام ، وقم بدوامة على مضرب الخرزة لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية.

جهاز طرد مركزي عند 15،000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المرحلة المائية بعناية إلى أنبوب ميكرو فوج جديد سعة 1.5 ملليلتر ، مع إضافة حجم متساو من 70٪ من الإيثانول. ثم قم بالتحميل على عمود الدوران وقم بالدوران عند 8 ، 000 × G.مع 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت RW ، اغسل كل عمود دوران مرة واحدة ، متبوعا بغسلتين ب 500 ميكرولتر من RPE العازلة.

انقل الأعمدة إلى أنابيب التجميع الجافة وقم بتدوير دقيقة إضافية لإزالة أي سائل متبقي. أخيرا ، استخدم 50 ميكرولترا من الماء لتصفية الحمض النووي الريبي. ثم استخدم مقياس الطيف الضوئي عند OD 216 animeter لقياس تركيز الحمض النووي الريبي.

لإجراء توصيف التعبير الجيني باستخدام الترميز الشريطي الرقمي ، ابدأ بإذابة مجموعة رموز المراسل ورمز الالتقاط على الجليد. أضف 130 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتهجين إلى مجموعة التعليمات البرمجية للمراسل. اقلبها للخلط والدوران.

بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من المزيج إلى كل أنبوب من أنابيب التفاعل ال 12. ثم أضف 10 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي للأنسجة إلى كل أنبوب واخلطه عن طريق سحب العينات. اعتمادا على نموذج العدوى وحجم اللقاح وسلالة العامل الممرض المستخدمة ، تختلف النسبة المئوية للحمض النووي الريبي الممرض داخل إجمالي الحمض النووي الريبي من 0 إلى 2٪ لذلك يجب تحسين الكمية الإجمالية للحمض النووي الريبي المطلوب إضافتها لكل منها تجريبيا.

أضف الآن خمسة ميكرولترات من رمز الالتقاط المحدد لكل أنبوب. امزج عن طريق قلب الأنابيب وتدور بسرعة. ثم احتضان التفاعلات في جهاز تدوير حراري عند 65 درجة مئوية بغطاء ساخن لمدة 18 ساعة تقريبا.

قم بإزالة خرطوشة عينة واحدة من 20 درجة مئوية واتركها دافئة إلى درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة لوحين كاشفين من أربع درجات مئوية وقم بتدويرها في جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة عند 670 × جم لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بإعداد محطة الإعداد باتباع الإرشادات خطوة بخطوة على الشاشة ، وتحديد خيار الحساسية العالية.

ثم قم بإزالة التفاعلات من التدوير الحراري وقم بتحميلها على الفور على محطة الإعداد. بعد تشغيل برنامج الحساسية العالية لمدة ثلاث ساعات ، قم بإزالة الخرطوشة واستخدم شريطا شفافا لإغلاق الممرات. ضع الزيت المعدني في قاع الخرطوشة إذا لزم الأمر.

ثم قم بتحميل الخرطوشة على المحلل الرقمي. قم بإعداد المحلل الرقمي باتباع الإرشادات خطوة بخطوة على الشاشة ، وحدد خيار المسح عالي الدقة. بعد تشغيل برنامج المسح ، قم بتنزيل النتائج أو اختر استلامها عبر البريد الإلكتروني واستيراد البيانات الأولية إلى برنامج الشركة المصنعة.

تحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص. يتمتع البروتوكول الموضح في هذا الفيديو بميزة فريدة من حيث أنه يستخدم كلا من مسبار الالتقاط ومسبار التقرير لزيادة الخصوصية وتقليل الضوضاء من الحمض النووي الريبي المضيف. كما هو موضح هنا ، كانت الأعداد الأولية في الخلفية من عينة الأنسجة غير المصابة أقل من 10 ، في حين أن الأعداد الأولية من عينتين من الأنسجة المصابة كانت جميعها أعلى من 10.

كان للتعداد الخام من عينتين بيولوجيتين ارتباط جيد جدا بقيمة R التربيعية البالغة 0.945. توفر المنصة أيضا نطاقا ديناميكيا كافيا ليشمل مستويات التعبير البيولوجي الطبيعي. باستخدام مجموعة مسبار تحدد 248 جينا للاستجابة البيئية ، تم تحديد مرحلتين من التعبير الجيني لمسببات الأمراض.

تشتمل استجابة التعبير الجيني المبكر على جينات ذات مستويات حمض الريبي تختلف اختلافا كبيرا بين اللقاح وعينات ما بعد 12 ساعة من الإصابة. كما تم اكتشاف استجابة تعبير جيني متأخرة تشتمل على جينات ذات مستويات الحمض النووي الريبي تختلف اختلافا كبيرا بين عينات 12 ساعة و 48 ساعة بعد الإصابة. تشير هذه النتائج إلى أن التعبير الجيني C.albicans يتم تنظيمه ديناميكيا أثناء الإصابة الغازية لمضيف الثدييات.

هذه الطريقة سهلة وسريعة. يتطلب الإجراء بأكمله من جمع الأنسجة إلى التعبير عن البيانات أقل من 48 ساعة. يستغرق التدريب العملي حوالي أربع ساعات ل 12 عينة.

بينما تم تطوير هذه الطريقة لالتقاط التعبير الجيني لمسببات الأمراض في الجسم الحي ، يمكن أيضا استخدام نفس الطريقة للإجابة على التعبير الجيني المضيف. لذلك ، يمكن للباحثين الحصول على معلومات مفيدة من كلا جانبي العدوى في وقت واحد.