كشف متعددة من البكتيريا الموجودة في مجمع العينات السريرية والبيئية باستخدام قليل النوكليوتيد ، بالإضافة نيون المجهرية

مرحبا ، أنا تيم دوسو من الزراعة والأغذية الزراعية الكندية. في هذا الفيديو، سنوضح بروتوكولا لتحديد وجود ووفرة كائنات دقيقة معينة في عينة سريرية أو بيئية معقدة باستخدام أداة بلكس حيوي. يستخدم هذا البروتوكول حبات البوليسترين الفلورية المقترنة كيميائيا بمسبار قليل النوكليوتيدات الخاص بالأنواع.

يتم إنشاء أمبليكون من العينة باستخدام بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل العالمية ويتم تهجين الأمبليكون إلى الخرز المقترن بالمسبار. يتم إنشاء إشارتين باستخدام أداة البلكس الحيوي. أحدهما يحدد الخرزة والآخر يحدد إشارة التهجين.

الهدف العام من الإجراء هو تحديد ملف تعريف الجراثيم ذات الأهمية بطريقة سريعة وشبه كمية. لقد طبقنا هذه التقنية لتحديد الملامح البكتيرية في المسحات المهبلية واستخدام البيانات التي تم إنشاؤها لتشخيص التهاب المهبل الجرثومي ، وهي حالة سريرية تتميز بتغيير في الجراثيم التي تصبح فيها الكائنات اللبنية أقل انتشارا وتصبح الكائنات الحية الأخرى مثل Gardnerella و vais و apoian vae قابلة للاكتشاف في المسحات المهبلية. ومع ذلك ، من المهم أن تضع في اعتبارك أنه يمكن تطبيق هذه التقنية على أي ميكروبات أخرى يكون فيها اختبار تعدد الإرسال السريع أمرا مرغوبا فيه.

لنبدأ بوصف كيفية عمل الإجراء. يتم إنشاء ملف تعريف ميكروبي عن طريق تضخيم بروتين وطلاء الجين المرافق في 60 من جميع الكائنات الحية الموجودة في مستخلص الحمض النووي للمسحة. يتم تعديل أحد بادئات التضخيم العالمية عن طريق إضافة البيوتين ، بالإضافة إلى إدراج القواعد المعدلة التي أكلت الفوسفو.

في النهاية الخمسة الأولية ، يتم جعل الأمبليكون مفردا تقطعت به السبل باستخدام T سبعة إكسون نيوكلياز ، مما يؤدي إلى تحلل الخيط المضاد للمعنى فقط. نظرا لأن خيط الإحساس محمي بواسطة برايمر تفاعل البوليميراز المتسلسل المعدل الذي يأكله الفوسفو ، فإن مجسات قليل النوكليوتيدات المكملة للخيط المتبقي تقترن تساهميا بخرز البوليسترين الفلوري. مع كل لون حبة فريد يحتوي على مسبار يكتشف كائنا مختلفا ، يمكن استخدام ما يصل إلى مائة حبة مختلفة لعينة واحدة.

يتم تهجين منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل أحادي الشريطة من المسحة المهبلية إلى خليط حبة مقترن بمسبار يحتوي على مجسات لجميع الكائنات الحية ذات الأهمية. تمت إضافة المراسل الفلوري FICO ethin الذي يرتبط بالمجسات الحيوية من خلال اقتران الدين العقدي. أخيرا ، يتم تحليل خليط التهجين على أداة luminex أو bioplex ، والتي تفحص كل حبة على حدة بحثا عن إشارة الهوية والتهجين.

تشير نتائج هذا التحليل إلى وجود كائنات دقيقة معينة وأن شدة إشارة التهجين ترتبط بوفرة هذا الكائن الحي. في العينة ، يمكن استخدام وجود الكائنات الحية ذات الصلة بالتهاب المهبل الالتهاب البكتيري لتشخيص التهاب المهبل البكتيري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل البقعة الكبرى ، هي أنه يتم إنشاء معلومات عن وجود كائنات دقيقة معينة ووفرتها.

توضيح الإجراء جينيفر تاون ، مساعد باحث في مختبرنا ، إعادة تعليق الكريات المجهرية عن طريق الدوامة لمدة 20 ثانية تقريبا. انقل 400 ميكرولتر من الكريات المجهرية إلى جهاز طرد مركزي لأنبوب einor عند 14 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة ، وقم بإزالة وتخلص من snat Resus. قم بتعليق الكريات المجهرية في 50 ميكرولتر من 0.1 مولار MES pH 4.5.

أضف أنيمو واحد من oligo الالتقاط إلى الكرات المجهرية واخلطه عن طريق الدوامة. أضف 2.5 ميكرولتر من محلول EDC الطازج إلى الكريات المجهرية. احتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.

تخلص من محلول EDC الذي تم تحضيره مسبقا وقم بإعداد عينة جديدة من 10 ملليغرام لكل مليلتر EDC في الماء. على النحو الوارد أعلاه ، أضف 2.5 ميكرولتر آخر من محلول EDC الطازج إلى الكريات المجهرية والدوامة لمدة خمس ثوان. احتضن مرة أخرى في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.

اغسل الخرزات بإضافة مليلتر واحد من دوامة Tween 20 0.02٪ لإعادة تعليق جهاز الطرد المركزي للحبات عند 14 ، 000 مرة G. لمدة دقيقة واحدة ، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها. اغسل الخرزات مرة أخرى بإضافة مليلتر واحد من 0.1٪ SDS Resus. قم بتعليق الخرز في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت te.

تعداد الخرزات في مقياس الخلوي الدموي لتحديد تركيز المخزون. قم بإعداد مزيج رئيسي من الكرة المجهرية عن طريق تخفيف كل حبة إلى تركيز نهائي يبلغ 100 حبة لكل ميكرولتر في تجمع العازلة te ، والخرز المقترن وفقا للبلكس المطلوب للفحص قم بتخزين مزيج الكرة المجهرية الرئيسي عند أربع درجات في الظلام. يمكن تخزين هذا الخليط لعدة أشهر إذا تم الاحتفاظ به في ظل هذه الظروف ، وقم بإنشاء منتج PCR لكل عينة.

قم بتضمين مجموعة التمهيدي الخمسة المعدلة من الفوسفولات والبيوتين مباشرة بعد اكتمال تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرة. أضف ميكرولترين من T سبعة نوكلياز خارجي إلى كل أنبوب PCR يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. في نهاية هذه الحضانة ، أضف 12.5 ميكرولتر من 0.5 مولر E-D-T-A-P-H 8.0 في المزيج.

هذا يعطي ما مجموعه حوالي 64.5 ميكرولتر من منتج PCR أحادي الشريط. مزيج Resus Bend Microsphere الرئيسي مع ماصة. استغن عن كمية مناسبة في أنبوب einor.

قم بتغطية الأنبوب والصوتنة في حمام مائي سونيكا لمدة دقيقتين. قم بتوزيع 17 ميكرولترا من منتج PCR أحادي الجداول في الآبار المناسبة ذات المستوى المنخفض 96. أضف طبق جيد 33 ميكرولترا من خليط حبة سونيك المعلق لكل منها.

قم بتغطية اللوحة بغطاء سيليكون وصنبور. ضع اللوحة برفق في thermocycler ببرنامج 95 درجة لمدة خمس دقائق ، و 60 درجة لمدة 10 دقائق ، و 60 درجة أو توقف مؤقتا لمدة 60 درجة لمدة خمس دقائق. انتهى ، ابدأ البرنامج.

اصنع محلول Aden FICO Ethin العقدي الطازج. ستحتاج إلى 25 ميكرولتر لكل بئر. اصنع البكتيريا العقدية والإيثين FICO عن طريق تخفيف الساق بمعدل واحد ملليغرام لكل مليلتر.

واحد في 50 إلى 20 ميكروغرام لكل مليلتر مع مخزن مؤقت TMC مرة واحدة. عندما يصل Thermocycler إلى خطوة التثبيت 60 درجة ، افتح الغطاء ، وقم بإزالة غطاء السيليكون وأضف محلول الإيثين العقدي الدين FICO مباشرة إلى كل منها. حسنا ، استبدل غطاء السيليكون ، وأغلق غطاء thermocycler واستأنف البرنامج.

عند اكتمال البرنامج ، أخرج اللوحة وانقلها بسرعة إلى آلة البلكس الحيوي للقراءة. يجب قراءة اللوحة في غضون 10 دقائق. اقرأ اللوحة عند 60 درجة.

تأكد من أن البلكس الحيوي قد تم تسخينه مسبقا لدرجة الحرارة هذه. يوضح هذا نتائج بقع الجرام المقابلة وملامح luminex للعينات الطولية من فرد واحد في الوقت الصفر. تتوافق صبغة الجرام مع التشخيص السريري ل bv ، ويتم تأكيد ذلك من خلال اختبار Fiveplex Luminex الذي يظهر إشارات تهجين إيجابية للكائنات الحية المرتبطة بالتهاب المهبل البكتيري ، بما في ذلك Gardner Relic و vais و Apoian Vae.

كما تم الكشف عن ملبنة Iners عند مستويات منخفضة مع تقدم الوقت. ينتقل هذا الفرد من الجراثيم BV إلى الجراثيم الطبيعية كما هو موضح في بقع الجرام. يظهر تحليل Luminex لهذه العينات نفسها أن وفرة Gardnerella Vaginalis تبلغ ذروتها وتتضاءل بينما تزداد العصيات اللبنية لتصبح الكائن الحي المهيمن بحلول النقطة الزمنية النهائية.

باستخدام هذه الطريقة لتوصيف معلومات الكائنات الحية الدقيقة ، يتم إنشاء معلومات حول وجود كائنات حية معينة بالإضافة إلى وفرتها. نظرا لأن الطريقة تعتمد على التسلسل ، يمكن إبلاغ تصميم المسبار من خلال تحليل التسلسل العميق ويمكن تتبع الكائنات الحية الدقيقة التي يتم تحديدها بواسطة طرق التسلسل من الجيل التالي في العينات بطريقة سريعة ومنخفضة التكلفة نسبيا. يجب أن تمنحك مشاهدة هذا الفيديو فهما جيدا لكيفية إنشاء ملف تعريف ميكروبي من عينة باستخدام أداة Luminex أو Bio Plex.

لقد أوضحنا لك كيفية إقران مجسات قليل النوكليوتيدات بخرز الفلورسنت ، وتوليد أليكون أحادي الجدول من عينة سريرية أو بيئية ، وإجراء التهجين ، وتحديد النتائج على أداة Luminex أو Bio Plex. حظا سعيدا في تجاربك.