آخر العمود اشتقاق عن طريق رد الفعل أعمدة تدفق عالية الأداء اللوني السائل

الهدف العام من هذه الطريقة هو تحسين كفاءة وحساسية الاشتقاق ما بعد العمود في الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء، أو طريقة PCD، من خلال استخدام عمود تدفق للتفاعل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات مثل العلوم الصيدلانية والطبية الحيوية والبيئية، حيث يتم تحليل المركبات التي تظهر استجابة منخفضة لكواشف HPLC. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في عدم الحاجة إلى ملفات تفاعل.

نظراً لأن خلط تدفق العمود ومادة الاشتقاق يتم بكفاءة أكبر من الطرق التقليدية، فقد استُخدمت هذه الطريقة لتقديم رؤى حول مضادات الأكسدة، والأحماض الأمينية، والفينولات. كما يمكن تطبيقها على فئات أخرى من المركبات، مثل الثيولات، والمعادن، والمضادات الحيوية، والسموم.

على الرغم من عدم إجراء عملية الاشتقاق للعينة بأكملها، إلا أن تركيز المادة المُحللة ضمن تدفق السائل الخارج يكون أعلى مما هو عليه في تحليل الاشتقاق التقليدي بعد العمود، وذلك بسبب انخفاض اتساع النطاق. لبدء هذا الإجراء، قم بتجهيز جهاز HPLC باستخدام ماء 100% في الخط A وميثانول 100% في الخط B كطور متحرك، مع تطهير المضخات وفقاً لمتطلبات الشركة المصنعة. قم بإعداد مكونات جهاز HPLC ومضخة الاشتقاق الإضافية.

بعد ذلك، اضبط كاشف UV/VIS للتحليل عند طول موجي يبلغ 520 nanometers. قم بتوصيل مدخل عمود تدفق التفاعل، أو RF، بجهاز HPLC. ثم صِل منفذًا طرفيًا للمخرج بكاشف UV/VIS باستخدام أنبوب بقطر داخلي 0.13 millimeter وطول 15 centimeter.

بعد ذلك، قم بتوصيل خط مضخة DPPH بمنفذ طرفي عند مخرج عمود RF. قم بسد المنفذ الطرفي غير المستخدم عند مخرج عمود RF باستخدام سدادة عمود. قم بتوصيل أنبوب بطول 15 سنتيمتر وقطر داخلي 0.13 مليمتر بالمنفذ المركزي لمخرج عمود RF.

اضبط معدل تدفق مضخة HPLC على 1 mm/min باستخدام 100% methanol. بعد ذلك، قم بموازنة العمود باستخدام 100% methanol لمدة 10 دقائق. في هذه المرحلة، قم بتحضير محلول بتركيز 0.1 mg/mL من DPPH وmethanol.

قم بإجراء المعالجة بالموجات فوق الصوتية للدورق الذي يحتوي على كاشف DPPH لمدة 10 دقائق. قم بتطهير مضخة DPPH باستخدام كاشف DPPH المُحضّر وفقاً لمتطلبات الشركة المصنعة. بعد ذلك، أحضر وعاءين جافين ونظيفين وقم بتمييز أحدهما بـ "مركزي" والآخر بـ "طرفي". قم بوزن الوعاءين بدقة.

اجمع السائل الخارج من المنفذ المركزي في الوعاء المسمى "central" لمدة دقيقة واحدة. بعد إعادة وزن وعاء المنفذ المركزي، احسب وزن التدفق من المنفذ المركزي. كرر الخطوات السابقة للسائل الخارج من جهاز UV/VIS المتصل بالمنفذ الطرفي لعمود RF.

احسب وزن وعاء المنفذ الطرفي. بعد ذلك، احسب النسبة المئوية للتدفق القادم من المنافذ المركزية والطرفية. كرر الخطوات السابقة حتى تصبح نسبة التدفق صحيحة، ثم اضبط معدل تدفق مضخة DPPH على 0.5 milliliters per minute.

بمجرد انتهاء التشغيل، أوقف تدفق مضخة كاشف الاشتقاق. قم بإزالة خط مضخة كاشف DPPH من المنفذ الطرفي وأغلق المنفذ بسدادة. قم بموازنة العمود باستخدام الطور المتحرك الذي سيتم تخزينه فيه، مع السماح للطور المتحرك بالمرور عبر العمود بمعدل 1 mm/min لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، أوقف تدفق مضخة مرحلة الفقاعات في جهاز HPLC. وأخيراً، استبدل كاشف DPPH بالميثانول وقم بتطهير المضخة الإضافية. يظهر هنا مخططان كروماتوغرافيان لعينة من قهوة ريستريتو، تم اشتقاقها باستخدام جذر DPPH باستخدام كل من جهاز PCD التقليدي وجهاز RF-PCD.

تظهر هنا حدود التحديد والكمية المحسوبة لكل حمض أميني تم تحليله في وضعي RF-PCD وPCD التقليدي. كما يتم عرض كروماتوغرام للأحماض الأمينية الأربعة التي تم تحليلها باستخدام طريقة PCD التقليدية، وطريقة RF-PCD، والتدفق غير المشتق من طريقة RF-PCD. وتظهر هنا مقارنة بين الإشارات التي تم الحصول عليها للقمم الخاصة بالجلايسين والليوسين باستخدام كل من طريقتي PCD التقليدية وRF-PCD.

تظهر هنا مقارنة لعرض ذروة التريبتوفان عند التحليل باستخدام طريقة PCD التقليدية، وطريقة RF-PCD، والتدفق غير المشتق من طريقة RF-PCD. تم فصل واشتقاق والكشف عن عينة اختبار مكونة من 21 مكوناً، تضمنت بعض المكونات التي تظهر استجابة لمخطط الاشتقاق ومكونات أخرى لا تظهر ذلك. كما تم فصل المزيج نفسه والكشف عنه دون اشتقاق لأغراض المقارنة.

يظهر هنا مقارنة لشكل ذروة para-Cresol، سواء كانت مشتقة باستخدام عمود RF-PCD أو غير مشتقة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إعدادها في نفس الوقت الذي يستغرقه تحليل الاشتقاق التقليدي بعد العمود. وعند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الالتزام بنسب التدفق المحددة قدر الإمكان.

باتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام كواشف أخرى للاشتقاق بعد العمود، مثل OPA أو ninhydrin أو الهالوجينات، من أجل تحليل مركبات أخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تتكون لديك فكرة جيدة عن كيفية إعداد وضبط عمود تدفق التفاعل.