ومن الطرق المباشرة لGlucosinolate استخراج وتحليل مع الضغط العالي اللوني السائل (HPLC)
مارس 15, 2017
هنا ، نصف بتفصيل كبير بروتوكولا راسخا وقويا لاستخراج الجلوكوزينولات من المواد النباتية المطحونة. بعد معالجة السلفاتاز على العمود للمستخلصات ، يتم تصريف مزيلات السلفوجلوكوزينات وتحليلها بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الضغط.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو إجراء تحليل سهل ومباشر للجلوكوزينات في النباتات والعينات البيولوجية الأخرى. يمكن استخدام هذه الطريقة لاستخراج وتحليل الجلوكوزينولات للإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيئة الحشرات النباتية ، وأمراض النبات ، وتربية النباتات ، وعلوم الغذاء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها معتمدة جيدا وقابلة للتطبيق على نطاق واسع على مجموعة واسعة من العينات البيولوجية.
على الرغم من أن هذه الطريقة تستخدم بشكل أساسي لتحديد كمية الجلوكوزينولات في المواد النباتية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على التربة أو المواد الغذائية الجاهزة. يمكن إجراء إجراء الاستخراج هذا في أي مختبر تقريبا لأنك تستخدم في الغالب معدات المختبر القياسية. بشكل عام ، سيقوم الأفراد الجدد بهذه الطريقة بإجراء التحليلات والفحص بشكل أفضل عندما يقرؤون الفيلم ويراقبونه مرة واحدة على الأقل.
لبدء الإجراء ، امزج 10 جرامات من جل الدكسترين المتقاطع G-25 مع 125 مل من الماء فائق النقاء. قم بتخزين الخليط في زجاجة مغطاة على حرارة 4 درجات مئوية. ثم قم بإذابة 10،000 وحدة من نوع H-1 أريل سلفاتاز في 30 مل من الماء فائق النقاء.
أضف إلى هذا 30 مل من الإيثانول المطلق وحرك الخليط جيدا. الطرد المركزي الخليط على حرارة 2 ، 650 مرة جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. امزج المادة الطافية مع 90 مل من الإيثانول المطلق في دورق
امزج واسكب أنابيب الطرد المركزي الجديدة. الطرد المركزي الخليط عند 1،030 مرة جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية.
قم بإذابة الكريات وخلطها في إجمالي 25 مل من الماء فائق النقاء. دوامة الخليط جيدا ثم نقل الخليط إلى أنابيب 1 ملليلتر. قم بتخزين عينات الكبريتات على حرارة 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد.
بعد ذلك ، تزن حوالي 90 ملليغرام من سينوغرام وسجل الوزن بدقة 1 ميكروغرام. ثم قم بإذابة أحادي الهيدرات سينوغرام في 10 مل من الماء عالي النقاء. قم بإعداد خمسة محاليل مرجعية من محلول مخزون الوغرام هذا بتركيزات تتراوح من 50 إلى 750 ميكرومولار.
قم بتخزين المحاليل المرجعية في أنابيب سعة 1.5 مليلتر عند 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، لكل عينة ومرجع ، قم بتسمية أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مليلتر في وضع رف العمود. اثقب كل غطاء أنبوب لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة بإبرة تشريح للتجفيف بالتجميد لاحقا.
ضع الأنابيب المسماة في كتلة بنفس التكوين والتباعد مثل الأعمدة المسماة. لتحضير أعمدة الماصة الزجاجية، استخدم قضيبا خشبيا أو زجاجيا للضغط برفق على قطعة من الصوف الزجاجي مقاس 1 سم × 1 سم في الماصة. قم بتعبئة الصوف الزجاجي عند انتقال برميل الماصة إلى الساق.
ضع عمود ماصة في كل موضع محدد على الحامل. ضع الرف فوق صينية النفايات. قطع نهاية طرف ماصة بلاستيكية سعة 1 ملليلتر.
رج جل الدكسترين المحضر جيدا. ثم استخدم طرف الماصة الموسع لتحميل 0.5 مل من هلام الدكسترين المحضر في كل عمود. افحص الأعمدة بحثا عن تسرب هلام الدكسترين واستبدل أي أعمدة متسربة.
بمجرد تحميل جميع الأعمدة بهلام الدكسترين ، اغسل كل عمود ب 1 ملليلتر من الماء عالي النقاء. تزن ما بين 50 و 100 ملليغرام من الخطوة الحرة ، والمواد النباتية المطحونة بدقة في أنبوب تفاعل سعة 2 مليلتر مع غطاء أمان ، وسجل الوزن بدقة 0.1 ملليغرام. ضع كرتين معدنيتين قطرهما 3 ملم في كل أنبوب.
أضف إلى كل أنبوب 1 مليلتر من 70٪ من الميثانول في ماء عالي النقاء ، وقم بدوامة كل خليط لفترة وجيزة. أغلق الأنابيب بأغطية أمان إضافية ، وضعها على الفور في حمام مائي من 90 إلى 92 درجة مئوية. سخني الأنابيب حتى يبدأ المنشار في الغليان.
انقل الأنابيب إلى حمام بالموجات فوق الصوتية ، وقم بتسخين العينات صوتيا لمدة 15 دقيقة. أثناء الصوتنة ، ابدأ في إذابة عينة الكبريتات ومراجع سينوغرام. بعد صوتنة ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 2 ، 700 مرة جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
قم بتحميل المواد الطافية ومراجع الرسم الجيبي المذابة على الأعمدة المقابلة ، مع الحرص على عدم سحب المواد النباتية إلى الماصة. أضف 1 مليلتر من 70٪ ميثانول إلى كل أنبوب. دوامة الخلائط.
وتسخين الخلطات بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة. الطرد المركزي الأنابيب مرة أخرى في نفس الظروف كما كان من قبل. قم بتحميل المواد الطافية على الأعمدة المقابلة.
أضف جزأين سعة 1 مليلتر من 70٪ من الميثانول إلى كل عمود ، مما يسمح للأعمدة بالجفاف بين كل جزء. اغسل الميثانول المتبقي من كل عمود ب 1 مليلتر من الماء عالي النقاء. بعد ذلك ، اغسل كل عمود بجزأين سعة 1 مليلتر من 20 مللي مولار من أسيتات الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 5.5.
بمجرد تصريف الأجزاء الأخيرة من عازلة أسيتات الصوديوم في رف النفايات ، قم بإزالة الرف من صينية النفايات وجفف أقدام الرف بالمناديل. ضع الحامل فوق كتلة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المسماة ، بحيث تكون أطراف الأعمدة في الأنابيب المقابلة. قم بتحميل 20 ميكرولترا من محلول الكبريتات على كل عمود ، مما يضمن وصول المحلول إلى سطح مادة العمود.
اغسل محلول الكبريتات في مادة العمود باستخدام 50 ميكرولتر من عازلة أسيتات الصوديوم. من المهم جدا أن يتم غسل الكبريتات في العمود. يجب أن يكون الإنزيم على العمود للتفاعل مع الجلوكوزينات السليمة المرتبطة بالعمود.
بمجرد غسل محلول الكبريتات على كل عمود ، قم بتغطية الأعمدة بورق الألمنيوم. اسمح للأعمدة بالوقوف طوال الليل. بعد ذلك ، ألمح إلى de-sulfo-glucosinolates من كل عمود بجزأين من 0.75 مليلتر من الماء عالي النقاء.
بمجرد أن تجف الأعمدة ، قم بإزالة رف العمود وغطاء كل أنبوب. قم بتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل ، أو عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. جفف العينات بالتجميد لمدة 12 إلى 24 ساعة.
قم بإذابة كل بقايا في 1 مليلتر من الماء عالي النقاء. ثم انقل كل عينة ومرجعا إلى قوارير عينة HPLC المسماة. افصل المستخلصات على عمود CAT عكسي الطور.
استخدم الطول الموجي للكشف يبلغ 229 نانومتر. بمجرد فصلها بواسطة HPLC ، يمكن تحديد الجلوكوزينولات من خلال مقارنة أوقات الاحتفاظ وأطياف الأشعة فوق البنفسجية مع معايير الجلوكوزينولات المعروفة. يتم حساب تركيزات الجلوكوزينولات في العينة من منحنى معايرة الجيوب الصينية ، وقيم الأدبيات لعوامل الاستجابة.
من هذا ، يمكن تحديد تركيزات الجلوكوزينولات في عينة النبات الأصلية. في ظل ظروف HPLC المستخدمة ، يلمح البروجويترين غير الصحي في وقت مبكر جدا ، ويتم فصله عن الجلوكورافانين المفيد بيولوجيا. كما يتم فصل الجلوكوزينولات الداخلي جيدا.
لوحظت سلسلة الليوتروبيك مع زيادة روابط السلسلة الجانبية للألكونول ، ميثيل فول ألكونول ، وميثيل سولفينول جلوكوزينات أطول سلسلة. وبالتالي يمكن تصنيف الجلوكوزينات غير المعروفة مبدئيا بناء على هذه السلاسل الليوتروبيك بالاشتراك مع أطياف الأشعة فوق البنفسجية. مع التحضير المناسب ، يمكن استخراج 150 إلى 200 عينة بواسطة شخص واحد في يوم عمل واحد.
سوف يستغرق الأمر يوما آخر للإشارة إلى الأعمدة تجميد العينات وتجفيفها ، وإعدادها ل HPLC. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تطبيق طرق أخرى ، مثل LCMS ، لتحديد ديسولفو جلوكوزينات غير معروفة في مخطط الكروماتوراث. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج الجلوكوزينولات من عيناتك البيولوجية وتحليلها عبر HPLC.
لا تنس أن العمل مع الميثانول يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب أن يتم دائما تحت غطاء الدخان.
النظرة العامة
يقدم هذا المقال بروتوكولًا مفصلًا لاستخراج الجلوكوزينولات من المواد النباتية باستخدام كروماتوجرافيا السائل عالية الضغط. تم تصميم هذه الطريقة لتكون مباشرة وقابلة للتطبيق على عينات بيولوجية مختلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيئة النبات والحشرات
- علم أمراض النبات
- علوم الأغذية
الخلفية
- الجلوكوزينولات هي مركبات مهمة في النباتات.
- تلعب دورًا في آليات دفاع النبات.
- فهم تركيزها يمكن أن يساعد في دراسات بيولوجية مختلفة.
- تم التحقق من هذا البروتوكول لمجموعة واسعة من العينات.
هدف الدراسة
- توفير طريقة موثوقة لاستخراج وتحليل الجلوكوزينولات.
- تسهيل البحث في المجالات المتعلقة بالنباتات.
- تمكين تحديد كمية الجلوكوزينولات في عينات متنوعة.
الطرق المستخدمة
- تحضير جل الدكسترين ومحلول السلفاتاز.
- استخراج العينات باستخدام الميثانول والصوتنة.
- كروماتوجرافيا السائل عالية الضغط للتحليل.
- مقارنة أوقات الاحتفاظ والأطياف فوق البنفسجية بالمعايير.
النتائج الرئيسية
- استخراج ناجح للجلوكوزينولات من المواد النباتية.
- التحقق من صحة الطريقة عبر عينات بيولوجية مختلفة.
- تحديد الجلوكوزينولات من خلال HPLC.
- تطبيقات محتملة في علم البيئة وعلوم الأغذية.
الاستنتاجات
- البروتوكول فعال لتحليل الجلوكوزينولات.
- يمكن استخدامه في إعدادات بحثية مختلفة.
- يمكن للدراسات الإضافية توسيع تطبيقاته في علوم النبات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of glucosinolates supports target validation in plant-based bioactive compound discovery, enabling mechanistic de-risking of nutraceutical and crop protection candidates. This method provides predictive confidence in identifying beneficial versus detrimental glucosinolate profiles, informing lead identification and portfolio triage in agricultural biotechnology and functional food development. Its broad applicability across plant tissues and biological samples enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific glucosinolate structures to biological activities such as progoitrin (detrimental) or glucoraphanin (beneficial).
- Operational Value: Supports biological de-risking through reliable quantification of intact glucosinolates after myrosinase inactivation and sulfatase treatment.
- Predictive Value: Facilitates predictive confidence in target validation by generating quantitative data for structure-activity relationship analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by delivering desulfoglucosinolates suitable for HPLC-based detection and quantification.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through sinigrin-based calibration curves and established response factors.
- Scalability: Enables processing of 150–200 samples per person per day, supporting high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase glucosinolate profiling to preclinical validation through disease-relevant systems in plant pathology and food sciences.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying harmful breakdown products (e.g., nitriles) versus beneficial ones (e.g., isothiocyanates) based on glucosinolate profiles.
- Biomarker Alignment: Enables translational biomarker development by correlating glucosinolate concentrations with phenotypic outcomes in ecological and breeding studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical support, particularly in nutraceutical and crop trait development pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying glucosinolate profiles that determine bioactive breakdown product formation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs via HPLC with PDA/UV detection, enabling reliable compound evaluation across diverse plant matrices.
- Analytics: Provides measurable readouts (retention times, UV spectra, concentration calculations) that allow cross-condition comparison and structure-based classification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through applications in food safety and plant health, where glucosinolate breakdown products influence biological outcomes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical platform due to its reliance on standard lab equipment and broad sample compatibility (plant, soil, foodstuffs).
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in bioactive compound identification.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across laboratories using accessible equipment.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in bioactive compound development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on validated glucosinolate quantification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant sample preparation, enzymatic treatment, and HPLC operation.
- Depends on access to centrifuges, water baths, ultrasonic baths, freeze-dryers, and HPLC systems with PDA/UV detection.
- Necessitates cross-team standardization of extraction timing, sulfatase incubation, and reference curve preparation.
- Involves adaptation considerations for varying plant matrices (leaf, seed, root) and non-plant samples (soil, foodstuffs).
- Includes practical limitations such as methanol handling hazards requiring fume hood use and the 12–24 hour freeze-dry step affecting turnaround time.
