الرقمية على microfluidics لتصنيع البروتين الآلي
November 6th, 2009
على microfluidics الرقمية هي تقنية تتميز التلاعب قطرات منفصلة (~ NL -- مل) على مجموعة من الأقطاب الكهربائية من تطبيق الحقول الكهربائية. انها مناسبة تماما للاضطلاع ، المتسلسل السريع ، المنمنمة الآلي فحوصات البيوكيميائية. هنا ، نحن تقرير منصة قادرة على أتمتة العديد من خطوات التجهيز البروتين.
البروتينات السريرية هي تخصص جديد مهم يعد باكتشاف المؤشرات الحيوية التي ستكون مفيدة للتشخيص المبكر والتشخيص للمرض. نبلغ هنا عن الموائع الدقيقة الرقمية الجديدة أو طريقة DMF التي تدمج العديد من خطوات المعالجة المستخدمة في البروتينات السريرية بما في ذلك استخراج البروتين وتقليل الذوبان والألكلة والهضم الأنزيمي. يستخدم DMF قطرات دقيقة منفصلة من بروتينات العينة على مجموعة من الأقطاب الكهربائية ويمكن تشغيلها في درجة حرارة الغرفة ، مما يسمح بالتحليل الآلي المتوازي للعينات.
تمثل هذه المنهجية تقدما كبيرا على الطرق التقليدية ولديها القدرة على أن تكون أداة جديدة مفيدة في علم البروتينات السريري. مرحبا ، أنا ستيف شي من أستاذ المختبر إيرين ويلر في قسم الكيمياء ومعهد المواد الحيوية والهندسة الطبية الحيوية في جامعة تورنتو. مرحبا ، أنا غابرييل من مختبر ويلر في جامعة تورنتو.
وأنا فيفيان لوك ، أيضا من مختبر Wearer في جامعة تورنتو. أنا إيرين ويلر. أنا محظوظ للعمل مع ستيف ميس وفيفيان.
سنعرض لك اليوم إجراء للمعالجة البروتينية باستخدام الموائع الدقيقة الرقمية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة البروتينات والعينات البيولوجية. لذلك دعونا نبدأ.
ابدأ الإجراء في غطاء الدخان عن طريق تنظيف الركائز الزجاجية في محلول سمكة البيرا. أثناء ارتداء الحماية الكافية ، يتكون محلول سمكة البيرانا من ثلاثة إلى واحد من حامض الكبريتيك المركز إلى 30٪ بيروكسيد الهيدروجين. لذلك يجب توخي الحذر أثناء العمل معها.
احتضان الركائز الزجاجية في سمكة البيرانا لمدة 10 دقائق وبعد التنظيف ، اشطفها ومنزوعة الأيونات أو دي الماء وجفف الركائز بغاز النيتروجين. ضع الركائز داخل غرفة تبخر شعاع الإلكترون لترسب الكروم بسمك 250 نانومتر. قم بإزالة الركائز من الغرفة بمجرد تحقيق هذا السماكة واشطفها بالأيزوبروبانول ، ثم جففها على طبق ساخن لمدة خمس دقائق عند 115 درجة مئوية.
قم بتجهيز الركائز المجففة بسداسي ميثيل زيلازين أو HMDS عن طريق طلاء الدوران في 30 ثانية. 3000 دورة في الدقيقة يدور رمز مرة أخرى مع صورة Shipley S 1811. مقاومة استخدام معلمات متطابقة.
اخبز الركيزة مسبقا مباشرة على طبق ساخن على حرارة 100 درجة مئوية في الدقيقة. ثم قم بتصميم مقاومة الصورة عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية أو الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس ثوان من خلال قناع الصورة. بعد ذلك ، قم بتطوير الركائز المعرضة للأشعة فوق البنفسجية في مطور Shipley MF 3 21 يكفي لغمر الركيزة لمدة ثلاث دقائق بعد ذلك.
شطف الركيزة في DI الماء عمود. اخبز مباشرة على طبق ساخن على حرارة 100 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. احفر الكروم المكشوف عن طريق غمر الركائز لمدة 30 ثانية في نقش ما يكفي من الكروم لتغطيتها بالكامل.
اشطف الركائز بماء DI واغمرها في أداة تجرية Z 300 T بما يكفي لغمر الركيزة لمدة 10 دقائق. لإزالة المقاومة الضوئية المتبقية. اشطفها بماء DI وجففها بغاز النيتروجين.
بعد هذا الإيداع ، من اثنين إلى خمسة ميكرومتر Paraline C. يودع بوليمر عازل على الركيزة عن طريق ترسيب البخار الكيميائي 50 نانومتر من Teflon AF لجعل السطح كارها للماء عن طريق طلاء الدوران محلول. 1٪ وزن لكل وزن في العصب الفلورا FC 40 عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية. على الركيزة.
كرر ذلك باستخدام أكسيد قصدير الإنديوم غير المنمر أو الركيزة الزجاجية ITO لإنشاء عمود اللوحة العلوية. اخبز كلتا الركيزتين على طبق ساخن على حرارة 160 درجة مئوية. 10 دقائق لإعداد جهاز الموائع الدقيقة الرقمي.
قم بإزالة طلاء البوليمر من وسادات التلامس للركيزة السفلية عن طريق الكشط بمشرط. قم بإقران الوسادات المكشوفة للركيزة السفلية مع 40 سنا من الموصلات التي تعمل على جهاز كمبيوتر يعمل بعرض المختبر. نحن نستخدم صندوق تحكم محلي الصنع يحتوي على مرحلات بإشارات يتم التحكم فيها بواسطة dpad.
يسهلصندوق التحكم في الكمبيوتر تحكم المستخدم في تطبيق إشارات RMS 100 فولت لكل 18 كيلو هرتز على الجهاز عبر موصلات 40 سنا. قم أيضا بتشغيل مولد ومكبر للصوت. قم بتجميع الجهاز عن طريق وضع قطعتين من الشريط على الوجهين بسماكة إجمالية تبلغ 140 ميكرومتر على حواف الركيزة السفلية.
ماصة أربعة ميكرولترات من ماء DI في أحد الخزانات وقم بإحاطة الجهاز عن طريق وضع شريحة أكسيد قصدير الإنديوم غير المنقوشة أعلى الجهاز مع توجيه الجانب المطلي بالتفلون لأسفل. قم بتوصيل موصل أرضي بتشغيل اللوحة العلوية. أنشأ المختبر برنامج التهيئة في عرض المختبر لمعايرة التحكم في التغذية الراجعة، أصبح الجهاز جاهزا الآن للتجارب.
في هذا البروتوكول ، سنستخدم ألبومين مصل الأبقار أو BSA كعينة بروتين لإثبات تصميم الموائع الدقيقة الرقمية واستخدامها. يتم تخفيف BSA في مخزن مؤقت للعمل أو WB مصنوع من 100 مللي مولار ثلاثي حمض الهيدروكلوريك 7.8 مع 0.08٪ أونيك F1 27 الوزن لكل حجم. قم بإعداد مليلتر واحد من كل عينة ومحلول كاشف وقم بالإشارة إلى الخزان الذي ستتم إضافته إليه.
بعد تحضير الكاشف، قم بإزالة اللوحة العلوية من الجهاز وقم بإدخال أربعة ميكرولترات من المحلول في الخزان المخصص لها. بعد ملء الخزانات ، استبدل اللوحة العلوية على الجهاز. استخدم برنامج عرض المختبر الداخلي لتنفيذ الخطوات التالية.
تذكر أن واجهة الكمبيوتر تسمح للمستخدم بتوزيع حوالي 600 نانولتر من قطرات الخزانات ومعالجة القطرات الموجودة على مجموعة الأقطاب الكهربائية. أولا ، قم بتوزيع قطرة من البروتين تحتوي على عينة من R واحد وقطرة من المرسب من R الثاني. ادمج القطرتين واترك القطرة المدمجة تحتضن لمدة خمس دقائق حتى تترسب البروتينات على السطح.
قم بتشغيل المادة الطافية بعيدا عن البروتين المترسب إلى خزان النفايات. R ثلاثة ، لغسل البروتين المترسب ، قم بتوزيع ثلاث قطرات من محلول الغسيل من R أربعة ودفعها عبر البروتين المترسب إلى خزان النفايات. اترك الراسب يجف وقم بتوزيع قطرة من المخزن المؤقت القابل للذوبان من R five على البروتين.
اترك المخزن المؤقت يحتضن لمدة 20 دقيقة حتى يذوب الراسب. بعد ذلك ، قم بتوزيع قطرة من عامل الاختزال من R ستة ودمجها مع قطرة العينة. امزج القطرة المدمجة عن طريق تشغيلها عبر ستة أقطاب كهربائية في نمط دائري.
اترك القطرة تحتضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. استغن عن قطرة من عامل الألكلة من R سبعة ودمجها مع قطرة العينة ، متبوعة بالخلط. اترك القطرة تحتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.
أخيرا ، قم بتوزيع قطرة من التربسين من R ثمانية ودمجها مع قطرة العينة ، متبوعة بالخلط. اترك القطرة تحتضن لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية في طبق بتري على طبق ساخن. لإنهاء التفاعل ، قم بإزالة اللوحة العلوية وإخماد عملية الهضم عن طريق سحب العينات.
أشر ستة ملليلتر من 2.5٪ حمض ثلاثي كلورو أسيتيك في الماء على قطرة التفاعل. قم بتنقية منتج التفاعل المروي عن طريق سحب قطرة العينة مباشرة من اللوحة السفلية. باستخدام طرف مضغوط C 18 ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، يمكن الآن تخفيف العينات حسب الحاجة وتقييمها بواسطة قياس الطيف الكتلي لتحديد البروتينات الموجودة في العينة باستخدام هذا النظام.
متبوعة ببروتينات المواصفات الكتلية ، تم تحديدها بدرجات احتمالية أقل من مرة واحدة E إلى سالب ثلاثة ، أي ما يعادل فاصل ثقة 99.9٪ وتغطيات تسلسل لا تقل عن 30٪ وبالتالي ، فإن DMF هي منهجية مفيدة للغاية لمعالجة العينات البروتينية الآلية. لذلك لقد أظهرنا اليوم للتو كيف نستخدم الموائع الدقيقة الرقمية لاستخراج البروتينات ومعالجتها بطريقة آلية. توفر هذه المنهجية حلا محتملا لفقدان العينة وتلوثها أثناء عزل البروتين وتحديده.
نأمل في تطبيق هذه الطريقة في المستقبل على التطبيقات البيولوجية الأخرى ، بما في ذلك المقايسات المناعية والمقايسات القائمة على الخلايا. عند إجراء هذا النوع من التجارب ، فإن أهم شيء هو أن تتذكر الاستمتاع بها. هذا كل شيء.
شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تناقش هذه المقالة طريقة جديدة للميكروجريان الرقمي (DMF) تدمج خطوات معالجة متعددة لعلم البروتينات السريري. تتيح التقنية معالجة قطرات صغيرة على مصفوفة من الأقطاب الكهربائية، مما يسهل التحليلات البيوكيميائية الآلية في درجة حرارة الغرفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم البروتينات السريري
- التحليلات البيوكيميائية
- الميكروجريان الرقمي
الخلفية
- يهدف علم البروتينات السريري إلى اكتشاف المؤشرات الحيوية لتشخيص المرض وتوقع تطوره.
- يمكن للميكروجريان الرقمي التعامل مع قطرات منفصلة للتحليل البيوكيميائي.
- يمكن للطريقة العمل في درجة حرارة الغرفة، مما يعزز معالجة العينات.
- إن أتمتة خطوات معالجة البروتينات أمر بالغ الأهمية للكفاءة.
هدف الدراسة
- عرض طريقة DMF جديدة لعلم البروتينات السريري.
- دمج استخراج البروتين، الذوبان، الاختزال، الألكيلة، والهضم.
- تبيان مزايا DMF مقارنة بالطرق التقليدية.
الطرق المستخدمة
- دمج خطوات معالجة البروتينات المتعددة باستخدام DMF.
- استخدام قطرات صغيرة منفصلة على مصفوفة من الأقطاب الكهربائية.
- أتمتة تحليل العينات.
- إجراء التجارب في درجة حرارة الغرفة.
النتائج الرئيسية
- نجحت طريقة DMF في أتمتة عدة خطوات من خطوات البروتينات.
- يتم تحقيق التحليل المتوازي للعينات بكفاءة.
- تظهر المنهجية تحسنًا كبيرًا على التقنيات التقليدية.
- تم تسليط الضوء على إمكانية التطبيق الواسع في علم البروتينات السريري.
الخلاصات
- تمثل طريقة DMF الجديدة تقدمًا كبيرًا في علم البروتينات السريري.
- تقدم منهجًا متنوعًا وفعالًا لاكتشاف المؤشرات الحيوية.
- قد تؤدي التطبيقات المستقبلية إلى تعزيز تشخيص وتوقع الأمراض في مراحلها المبكرة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Digital microfluidics (DMF) addresses a key bottleneck in clinical proteomics by automating multi-step protein processing workflows, reducing manual handling and associated variability. This enables reproducible, high-throughput preparation of samples for biomarker discovery, directly supporting early-stage target validation and assay development. By integrating extraction, solubilization, reduction, alkylation, and digestion on a single platform, DMF enhances predictive confidence in proteomic data generation for downstream R&D decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through automated, reproducible protein sample preparation from complex biological fluids.
- Operational Value: Reduces manual pipetting steps, minimizing sample loss and contamination during upstream processing.
- Predictive Value: Supports biomarker identification with high sequence coverage and confidence scores, improving target selection reliability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitatively processable protein digests suitable for mass spectrometry-based screening campaigns.
- Operational Value: Facilitates parallel processing of multiple samples, increasing throughput for hit confirmation and lead profiling.
- Assay Readiness: Produces consistent enzymatic digestion outputs, enabling reliable compound evaluation in proteomic screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase proteomics with preclinical validation by ensuring consistent sample preparation across study stages.
- Mechanistic De-risking: Reduces variability in post-translational modification analysis, supporting confident pathway elucidation.
- Predictive Confidence: Enables reproducible generation of proteomic datasets used to inform go/no-go decisions in target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
DMF fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven proteomics from initial target engagement through lead identification by delivering standardized, automation-ready sample inputs.
- Discovery Biology: Supports functional target validation by enabling reproducible processing of disease-relevant protein samples from serum or cell lysates.
- Screening: Delivers assay-ready peptide mixtures with consistent digestion efficiency, enabling reliable LC-MS/MS readouts for compound screening.
- Analytics: Generates quantitative, high-confidence proteomic outputs (e.g., sequence coverage >30%, probability scores <1e-3) that facilitate comparative condition analysis.
- Translational Research: Ensures sample preparation consistency from discovery through preclinical stages, supporting biomarker alignment and validation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for automated proteomic processing across multiple projects, reducing revalidation burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein sample preparation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of proteomic workflows through automated droplet manipulation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing reagent waste and enabling parallel sample processing.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through reliable, high-quality proteomic data for target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, surface chemistry, and electrode-based fluid control.
- Depends on access to microfabrication tools (e.g., spin coater, UV exposure system) and instrumentation for electrochemical actuation.
- Necessitates cross-team standardization of device preparation protocols to ensure inter-laboratory reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse sample types (e.g., serum, whole blood, cell lysates) due to varying viscosity and protein content.
- Practical limitations include the need for cleanroom-compatible fabrication steps and careful handling of hydrophobic surfaces to maintain droplet integrity.
