الرقمية على microfluidics لتصنيع البروتين الآلي

تعد البروتوميات السريرية تخصصاً جديداً وهاماً يَعِدُ باكتشاف المؤشرات الحيوية التي ستكون مفيدة في التشخيص المبكر للأمراض وتوقع سير المرض. ونعرض هنا طريقة جديدة للموائع الدقيقة الرقمية (DMF) تدمج عدة خطوات معالجة مستخدمة في البروتوميات السريرية، بما في ذلك استخلاص البروتين، وإعادة الإذابة، والاختزال، والألكلة، والهضم الإنزيمي. تعتمد تقنية DMF على قطيرات دقيقة منفصلة من بروتينات العينة فوق مصفوفة من الأقطاب الكهربائية، ويمكن تشغيلها في درجة حرارة الغرفة، مما يسمح بإجراء تحليل آلي متوازٍ للعينات.

تمثل هذه المنهجية تقدماً ملحوظاً مقارنة بالطرق التقليدية، وتمتلك القدرة على أن تكون أداة جديدة ومفيدة في البروتوميات السريرية. مرحباً، أنا ستيف شي من مختبر الأستاذة إيرين ويلر في قسم الكيمياء ومعهد المواد الحيوية والهندسة الطبية الحيوية بجامعة تورنتو. مرحباً، أنا غابرييل من مختبر ويلر بجامعة تورنتو.

وأنا فيفيان لوك، من مختبر ويرر أيضاً في جامعة تورنتو. وأنا إرين ويلر، وأنا محظوظة بالعمل مع ستيف ميس وفيفيان.

سنعرض لكم اليوم إجراءً للمعالجة البروتومية باستخدام الموائع الدقيقة الرقمية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة البروتينات والعينات البيولوجية. لذا، دعونا نبدأ.

ابدأ الإجراء داخل خزانة طرد الغازات عن طريق تنظيف الركائز الزجاجية في محلول Piranha. يتكون محلول Piranha، مع ارتداء أدوات الحماية المناسبة، من حمض الكبريتيك المركز إلى بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 30% بنسبة ثلاثة إلى واحد. لذا يجب توخي الحذر عند التعامل معه.

قم بتحضين الركائز الزجاجية في محلول البيرانا لمدة 10 دقائق، وبعد التنظيف، اشطفها بالماء منزوع الأيونات وجفف الركائز بغاز النيتروجين. ضع الركائز داخل غرفة التبخير بحزمة الإلكترونات لترسيب الكروم بسماكة 250 nanometers. أخرج الركائز من الغرفة بمجرد الوصول إلى هذه السماكة، واشطفها بالإيزوبروبانول، ثم جففها على لوح تسخين لمدة خمس دقائق عند 115 °C.

قم بتجهيز الركائز المجففة باستخدام hexa methyl xylazine أو HMDS عن طريق الطلاء الدوراني لمدة 30 ثانية. ثم قم بالطلاء الدوراني مرة أخرى بسرعة 3000 RPM باستخدام Shipley S 1811 photo resist مع اتباع نفس المعايير.

قم بخبز الركيزة مسبقاً مباشرة على لوح تسخين عند 100 درجة مئوية لعدة دقائق. بعد ذلك، قم بتشكيل المقاوم الضوئي عن طريق التعريض للأشعة فوق البنفسجية UV لمدة خمس ثوانٍ من خلال قناع ضوئي. تلي ذلك عملية تحميض الركائز التي تعرضت للأشعة فوق البنفسجية في محلول تحميض Shipley MF 3 21 بكمية كافية لغمر الركيزة لمدة ثلاث دقائق بعد ذلك.

اشطف الركيزة بماء منزوع الأيونات (DI water) بعد ذلك. قم بالتجفيف الحراري مباشرة على لوح تسخين عند 100 degree Celsius لمدة دقيقة واحدة. قم بنقش الكروم المكشوف عن طريق غمر الركائز لمدة 30 ثانية في كمية كافية من محلول نقش الكروم لتغطيتها بالكامل.

اشطف الركائز باستخدام الماء منزوع الأيونات (DI water) واغمرها في مادة Z 300 T المزيلة بكمية كافية لتغطية الركيزة لمدة 10 دقائق، وذلك لإزالة ما تبقى من مقوم الضوء (photoresist). اشطف الركائز في الماء منزوع الأيونات (DI water) وجففها باستخدام غاز النيتروجين.

بعد هذا الترسيب، يتم ترسيب بوليمر عازل من Paraline C بسماكة تتراوح من اثنين إلى خمسة ميكرومتر على الركيزة عن طريق الترسيب الكيميائي للبخار، ثم يتم ترسيب 50 nanometers من Teflon AF لجعل السطح كارهاً للماء عن طريق طلاء دوراني لمحلول بتركيز 1%weight per weight في flora nerve FC 40 عند 2000 RPM لمدة 60 ثانية على الركيزة.

كرر العملية باستخدام ركيزة زجاجية من أكسيد القصدير والإنديوم (indium tin oxide) أو ITO غير الممررة لإنشاء القطب العلوي. قم بخبز كلتا الركيزتين على لوح تسخين عند 160 درجة Celsius لمدة 10 دقائق لتجهيز جهاز الموائع الدقيقة الرقمي.

قم بإزالة طبقات البوليمر من منصات التلامس في الركيزة السفلية عن طريق الكشط باستخدام المشرط. قم بتوصيل المنصات المكشوفة في الركيزة السفلية بموصلات ذات 40 دبوساً، ثم قم بتشغيل جهاز كمبيوتر يعمل ببرنامج lab view. نستخدم صندوق تحكم مُصنع محلياً يحتوي على مرحّلات يتم التحكم في إشاراتها بواسطة dpad.

يسهل صندوق التحكم بالحاسوب تحكم المستخدم في تطبيق إشارات بقيمة 100 volts RMS لكل 18 kilohertz على الجهاز عبر الموصلات ذات الـ 40 pin. قم أيضاً بتشغيل مولد الدوال ومضخم الصوت. قم بتجميع الجهاز عن طريق وضع قطعتين من الشريط اللاصق مزدوج الوجه بسماكة إجمالية قدرها 140 micrometer على حواف الركيزة السفلية.

قم بنقل 4 µL من الماء منزوع الأيونات (DI water) باستخدام الماصة إلى أحد الخزانات، ثم أغلق الجهاز بوضع شريحة أكسيد القصدير المصبوب (indium tin oxide) غير المنقوشة فوق الجهاز بحيث يكون الجانب المطلي بالتفلون متجهاً للأسفل. قم بتوصيل موصل أرضي بالصفيحة العلوية. قم بتشغيل برنامج التهيئة الذي تم إنشاؤه في المختبر عبر برنامج LabVIEW لمعايرة التحكم في التغذية الراجعة، وبذلك يصبح الجهاز جاهزاً للتجارب.

في هذا البروتوكول، سنستخدم ألبومين المصل البقري أو BSA كعينة بروتينية لاستعراض تصميم واستخدام الموائع الدقيقة الرقمية. يتم تخفيف BSA في محلول منظم للعمل أو WB يتكون من 100 millimolar tris HCL pH 7.8 مع 0.08%onic F1 27 weight per volume. قم بتحضير واحد milliliter من كل عينة ومحلول كاشف، وحدد الخزان الذي ستتم إضافتها إليه.

بعد تحضير الكاشف، قم بإزالة اللوح العلوي من الجهاز واسحب 4 µL من المحلول باستخدام الماصة وضعها في الخزان المخصص لها. بعد ملء الخزانات، أعد اللوح العلوي إلى الجهاز. استخدم برنامج LabVIEW الخاص بالمختبر لتنفيذ الخطوات التالية.

تذكر أن واجهة الكمبيوتر تتيح للمستخدم توزيع قطرات بحجم 600 nanoliter تقريباً من الخزانات والتحكم في هذه القطرات على مصفوفة الأقطاب الكهربائية. أولاً، قم بتوزيع قطرة من عينة تحتوي على البروتين من R one وقطرة من مادة المرسب من R two. ادمج القطرتين واترك القطرة المدمجة لتحضن لمدة خمس دقائق حتى تترسب البروتينات على السطح.

انقل السائل الطافي بعيداً عن البروتين المترسب إلى خزان النفايات. وفي الخطوة R three، ولغسل البروتين المترسب، قم بصرف ثلاث قطرات من محلول الغسيل المنظم من R four ومررها فوق البروتين المترسب وصولاً إلى خزان النفايات. اترك الراسب ليجف، ثم قم بصرف قطرة من محلول إعادة الإذابة المنظم من R five فوق البروتين.

اترك المنظم يتحضن لمدة 20 دقيقة حتى تذوب الرواسب. بعد ذلك، قم بتوزيع قطرة من العامل المختزل من R6 وادمجه مع قطرة العينة. اخلط القطرة المدمجة عن طريق تحريكها عبر ستة أقطاب كهربائية في نمط دائري.

اترك القطرة لتتحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بتوزيع قطرة من عامل الألكلة من R seven وادمجهما مع قطرة العينة، ثم قم بالمزج. اترك القطرة لتحتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع حمايتها من الضوء.

وأخيراً، قم بتوزيع قطرة من trypsin من R eight ودمجها مع قطرة العينة، ثم اخلطهما. اترك القطرة لتحتضن لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية في طبق بتري على لوح تسخين. ولإيقاف التفاعل، قم بإزالة اللوح العلوي وإخماد عملية الهضم باستخدام الماصة.

ضع 0.6 mL من حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك بتركيز 2.5% في الماء فوق قطرة التفاعل. قم بتنقية ناتج التفاعل الموقوف عن طريق سحب قطرة العينة مباشرة من اللوحة السفلية. باستخدام C 18 zip tip، ووفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، يمكن الآن تخفيف العينات حسب الحاجة وتقييمها بواسطة مطياف الكتلة لتحديد البروتينات الموجودة في العينة باستخدام هذا النظام.

بعد ذلك، تم تحديد البروتينات بواسطة مطياف الكتلة بدرجات احتمالية أقل من 1×10⁻³، وهو ما يعادل فاصل ثقة بنسبة 99.9% وتغطية للتسلسل بنسبة 30% على الأقل. وبناءً على ذلك، تعد تقنية DMF منهجية مفيدة جداً للمعالجة الآلية لعينات البروتينات. لقد استعرضنا اليوم كيفية استخدام الموائع الرقمية الدقيقة لاستخلاص ومعالجة البروتينات بطريقة مؤتمتة. وتوفر هذه المنهجية حلاً محتملاً لمشكلتي فقدان العينات والتلوث أثناء عمليات عزل البروتينات وتحديدها.

نأمل في تطبيق هذه الطريقة مستقبلاً في تطبيقات بيولوجية أخرى، بما في ذلك المقاييس المناعية والمقاييس القائمة على الخلايا. وعند إجراء هذا النوع من التجارب، فإن الأمر الأكثر أهمية هو تذكر الاستمتاع بها. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.