الكمي من الشلل الأوعية الدموية العمارة باستخدام ثنائي الفوتون المجهري في نموذج الفأر من Neuroinflammation التي يسببها فيروس نقص المناعة البشرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التغيرات في شبكات الشعيرات الدموية القشرية بعد التعرض لفترة طويلة لذيفان فيروس نقص المناعة البشرية، tat. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فحص التغيرات الرئيسية في مورفولوجيا الشعيرات الدموية القشرية والتي قد تساهم في إمراض الاضطرابات المعرفية العصبية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بالقياس الكمي الدقيق فسيولوجياً لعدة معاملات مورفولوجية للشعيرات الدموية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة في مسببات الاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس HIV، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على أمراض أخرى تحدث فيها تغيرات وعائية، مثل مرض الزهايمر. ابدأ هذا الإجراء بوضع هلام الدموع الاصطناعية على عيني فأر تحت التخدير.

بعد ذلك، قم بحلاقة رأس الحيوان باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. ثم، ضع محلول بوفيدون يود لتعقيم فروة الرأس، واتركه حتى يجف. وباستخدام مجهر ضوئي، قم بإزالة فروة رأس الحيوان للكشف تماماً عن العظام الجدارية، والعظام الجبهية الذيلية، ونقطة البريغما.

ضع كمية صغيرة من محلول كلوريد الحديديك بتركيز 10% على الجمجمة، وذلك لتجفيف الغشاء لتسهيل إزالته. بعد ذلك، قم بإزالة الغشاء المجفف عن طريق كشط الجمجمة برفق باستخدام الملقط. ثم ضع طبقة رقيقة من الغراء حول نافذة صفيحة الرأس.

اضغط بلطف على الصفيحة الرأسية مقابل جمجمة الفأر، للحفاظ على المنطقة المستهدفة في مركز النافذة. بعد ذلك، ضع قطرة من الأسمنت السني على الصفيحة الرأسية لبلمرة الغراء. ثم ضع طبقة رقيقة من الغراء على طول حافة نافذة الصفيحة الرأسية لإنشاء خزان لاحتواء المحلول الملحي.

بمجرد جفاف الغراء، قم بتثبيت لوحة الرأس في حزام لوحة رأس الفأر باستخدام البراغي. قم بإزالة أي غراء من نافذة لوحة الرأس باستخدام ريشة مثقاب مثبتة في مثقاب micro-torp، مضبوط على سرعة 6,000 rpm. توقف كل 10 إلى 15 ثانية لمنع ارتفاع درجة حرارة جمجمة الفأر.

بعد ذلك، وباستخدام ريشة مثقاب جديدة، ابدأ في ترقيق الجمجمة باستخدام مثقاب micro-torp مضبوط على 4,000 rpm. حرك المثقاب برفق عبر الجمجمة دون تطبيق ضغط مباشر لأسفل. وبمجرد ترقيق الجمجمة تماماً، افصل الفأر عن الحامل وضعه على ظهره.

ثبّت كلا الطرفين الخلفيين بلطف باستخدام الشريط اللاصق للكشف بوضوح عن الفخذين الإنسيين. ثم قم بإزالة الشعر عن كلا الفخذين الإنسيين وعقم موقع الجراحة بتغطية الفخذين بمحلول بوفيدون يود. بعد ذلك، قم بإزالة الجلد بلطف من الفخذ الأيمن الإنسي، فوق الوريد والشريان الفخذيين.

ضع ما يقرب من ثلاث إلى خمس قطرات من المحلول الملحي بتركيز 0.9% على موقع الجراحة. بعد ذلك، افصل الوريد الفخذي عن الشريان عن طريق التشريح غير الحاد للحزمة الوعائية العصبية الفخذية. والآن، ضع قطعتين من خيوط الجراحة بطول ثلاثة سنتيمترات تحت الشريان الفخذي، بحيث تفصل بينهما مسافة سنتيمتر واحد تقريباً.

قم بلف الغرزة العلوية في اتجاه عقارب الساعة لإنشاء عاصبة وعائية تساعد في منع فقدان الدم المفرط أثناء عملية القسطرة. بعد ذلك، قم بعمل شق صغير في الشريان الفخذي باستخدام مقصات زنبركية، حيث سيتم إدخال القسطرة لاحقاً لمراقبة المعاملات الفسيولوجية للفأر. في هذا الإجراء، قم بإزالة الجلد من الفخذ الأيسر الإنسي للفأر.

بعد ذلك، حدد موقع الوريد الفخذي. باستخدام سرنجة سعة 1 مل وإبرة قياس 30، اسحب 130 µL من محلول الصبغة الفلورية. احقن 100 µL من الصبغة ببطء في الوريد الفخذي.

بعد إزالة الإبرة، يتم تطبيق ضغط خفيف وثابت على موقع الحقن لإيقاف أي نزيف والسماح للصبغة بالدوران لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يتم إغلاق موقع الجراحة باستخدام الغرز الجراحية. ثم يُقلب الفأر بعناية على بطنه ويوضع في حزام لوحة تثبيت رأس الفأر.

من أجل التصوير ثنائي الفوتون في الجسم الحي، انقل الجهاز الجراحي إلى المجهر ثنائي الفوتون وتأكد من الحفاظ على مستوى تخدير الحيوان. بعد ذلك، ضع كمية صغيرة من المحلول الملحي بتركيز 0.9% في خزان الصفيحة الرأسية، ثم اخفض عدسة المجهر الشيئية بحيث تلامس المحلول الملحي. ثم حدد المنطقة المطلوبة باستخدام عدسة الرؤية ذات المجال المضيء.

بعد ذلك، ابدأ بالتصوير ثنائي الفوتون. حدد موقع شبكة شعيرات دموية على شاشة العرض وقم بتكبير هذه المنطقة باستخدام الزووم البصري أيضاً. التقط صوراً للشعيرات الدموية باستخدام برنامج التصوير ثنائي الفوتون.

لإجراء التصوير ثنائي الفوتون خارج الجسم (ex vivo)، قم بعمل شق في فروة الرأس من العظام بين الجدارية إلى العظام الجبهية للفأر المقطوع الرأس. ثبّت الجلد على جانبي الجمجمة باستخدام إصبع السبابة والإبهام، وضع مقصاً فائق الدقة أسفل العظم بين الجداري الإنسي واقطع الجمجمة على طول الدرز السهمي حتى نقطة تبعد حوالي 3 mm بعد نقطة البريغما (bregma). بعد ذلك، افصل الجمجمة عن الدماغ وأزل أي سحايا بعناية من سطح الدماغ باستخدام الملقط.

مرر الملقط برفق تحت الدماغ لتحريره من الجمجمة. بعد ذلك، ضع الدماغ في قالب تثبيت الدماغ (brain matrix) المخصص للفئران، واغسله بقطرات من ACSF. بعد ذلك، استأصل مقطعاً تاجياً (coronal section) من الدماغ بسمك 1 مليمتر.

ضع مقطع الدماغ على شريحة زجاجية مقعرة تحتوي على ACSF، بحيث يكون الجزء الأكثر أمامية من المقطع متجهًا للأعلى. ثم غطِّ شريحة الدماغ برفق بغطاء شريحة زجاجي. انقل الشريحة إلى منصة المجهر وضع كمية صغيرة من 0.9% saline على غطاء الشريحة.

اخفض عدسة microscope حتى تلامس المحلول الملحي. بعد ذلك، حدد الخط المتوسط للدماغ باستخدام عدسة bright field. الآن، ابدأ التصوير ثنائي الفوتون (two photon imaging)، وحدد الخط المتوسط مرة أخرى باستخدام عدسة 25x.

أنجز ذلك من خلال البحث عن الشق الطولي عند السطح القشري للمقطع الإكليلي. بعد ذلك، ضع الحافة اليمنى لشاشة التصوير على الخط المتوسط وحرّك شاشة العرض جانبيًا عبر ثلاثة إطارات كاملة. حدد العمق الذي تكون عنده الشعيرات الدموية مرئية بالكاد على شاشة العرض.

بعد ذلك، قم بخفض مستوى التركيز بمقدار 20 micrometers إضافية لتحديد الجزء العلوي من مكدس z-stack. اضبط سُمك الصورة على one micrometer. اخفض شاشة العرض بمقدار 100 micrometers واضبط قوة الليزر بحيث تكون نسبة البكسلات المشبعة بشكل مفرط أقل من واحد بالمائة.

وأخيرًا، قم بالتقاط مجموعة الصور المتسلسلة عموديًا (z-stack). في هذا الشكل، وبعد تحضير شريحة الدماغ، يتم تحديد منطقة تصوير تبعد حوالي 1.5 ملليمتر عن الخط المتوسط. وتنتج مجموعة z-stack بطول 100 ميكرومتر صورة ثلاثية الأبعاد تُستخدم للتحليل في برنامج Amira Analytical Software.

يتم بعد ذلك تتبع الشبكة الشعيرية يدويًا عن طريق وضع عقد عند بداية ونهاية الشعيرة الدموية أو في أي موقع تتفرع فيه شعيرة إلى أخرى. ينتج عن ذلك صورة هيكلية كاملة يتم من خلالها استخراج المعاملات المورفولوجية تلقائيًا. ويمكن استخراج عدد العقد الشعيرية، والقطع، ومتوسط طول القطعة، وإجمالي طول القطع باستخدام التصوير ثنائي الفوتون خارج الجسم لشرائح دماغ الفأر.

في هذه التجربة، يتم إنتاج صورة ثنائية الأبعاد لشبكات الشعيرات الدموية عن طريق التصوير الحي (in vivo)، حيث يمكن استخلاص قطر الشعيرات الدموية وحساب الحجم الكلي للشعيرات باستخدام القطر وطول الجزء الكلي الذي تم الحصول عليه من التصوير خارج الجسم (ex vivo). وبمجرد إتقان هذا الإجراء، يمكن إكماله في ثلاث ساعات ونصف إذا نُفذ بشكل صحيح. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التحرك بسرعة مع الحفاظ على مستوى ثابت من التخدير، لأن مادة isoflurane يمكن أن تسبب توسع الأوعية الدموية في الشعيرات القشرية، مما يؤدي إلى تحريف البيانات.

خلال هذا الإجراء، يمكن الحصول على معاملات شعيرية أخرى، مثل سرعة خلايا الدم الحمراء أو تدفق خلايا الدم الحمراء، والتي يمكن أن توفر فهماً أعمق للتغيرات الممرضة التي تظهر في الاضطرابات المعرفية العصبية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية HIV والأمراض التنكسية العصبية الأخرى. بالتوفيق في تجاربكم.