الكمي من الشلل الأوعية الدموية العمارة باستخدام ثنائي الفوتون المجهري في نموذج الفأر من Neuroinflammation التي يسببها فيروس نقص المناعة البشرية
January 12th, 2016
تصف هذه الورقة طريقة يمكن من خلالها قياس بنية الأوعية الدموية في الدماغ باستخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون في الجسم الحي وخارج الجسم الحي.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التغيرات في الشبكات الشعرية القشرية بعد التعرض المطول للسموم الفيروسية لفيروس العوز المناعي البشري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فحص التغييرات الرئيسية في مورفولوجيا الشعيرات الدموية القشرية التي قد تساهم في التسبب في الاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالقياس الكمي الدقيق من الناحية الفسيولوجية للمعلمات المورفولوجية الشعرية المتعددة.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للتسبب في الاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية. يمكن تطبيقه أيضا على الأمراض الأخرى التي تحدث فيها تغيرات في الأوعية الدموية مثل مرض الزهايمر. ابدأ هذا الإجراء بوضع جل دموع اصطناعي على عيون فأر مخدر.
بعد ذلك ، احلق رأسه باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. ثم ضع محلول اليود بوفيدون لتعقيم فروة الرأس واتركها تجف. تحت المجهر الضوئي ، قم بإزالة فروة رأس ، لفضح العظام الجدارية والعظام الأمامية الذيلية ونقطة بريجما تماما.
ضع كمية صغيرة من محلول كلوريد الحديديك بنسبة عشرة بالمائة على الجمجمة ، لتجفيف الغشاء لسهولة إزالته. بعد ذلك ، قم بإزالة الغشاء المجفف ، عن طريق كشط الجمجمة برفق باستخدام الملقط. ثم ضع طبقة رقيقة من الغراء حول نافذة لوحة الرأس.
اضغط برفق على لوحة الرأس على جمجمة الماوس ، للحفاظ على منطقة الاهتمام في وسط النافذة. بعد ذلك ، ضع قطرة من الأسمنت السني على لوحة الرأس لبلمرة الغراء. بعد ذلك ، ضع طبقة رقيقة من الغراء على طول حافة نافذة لوحة الرأس لإنشاء خزان لتثبيت المحلول الملحي.
بمجرد أن يجف الغراء ، قم بربط لوحة الرأس في حزام لوحة رأس الماوس. قم بإزالة أي غراء من نافذة لوحة الرأس باستخدام مثقاب متصل بمثقاب التورب الصغير ، على 6 ، 000 دورة في الدقيقة. توقف كل 10 إلى 15 ثانية لمنع ارتفاع درجة حرارة جمجمة الماوس.
بعد ذلك ، باستخدام مثقاب جديد ، ابدأ في ترقق الجمجمة باستخدام مثقاب التورب الصغير عند 4 ، 000 دورة في الدقيقة. حرك المثقاب برفق عبر الجمجمة دون ضغط مباشر لأسفل. بمجرد ترقق الجمجمة تماما ، افصل الماوس عن الحامل وضعه على ظهره.
قم بلصق كلا الطرفين الخلفيين برفق لكشف الفخذين الإنسي بوضوح. ثم قم بإزالة الشعر فوق كلا الفخذين الإنسي وتطهير موقع الجراحة عن طريق تغطية الفخذين باليود البوفيدون. بعد ذلك ، قم بإزالة الجلد برفق على الفخذ الأيمن الإنسي ، فوق الوريد الفخذي والشريان.
ضع ما يقرب من ثلاث إلى خمس قطرات من محلول ملحي 0.9٪ على موقع الجراحة. بعد ذلك ، افصل الوريد الفخذي عن الشريان ، عن طريق تشريح صريح إلى حزمة الأوعية الدموية العصبية الفخذية. الآن ، ضع قطعتين من الخيط الجراحي بطول ثلاثة سنتيمترات ، أسفل الشريان الفخذي ، على بعد سنتيمتر واحد تقريبا.
قم بلف الخيط العلوي في اتجاه عقارب الساعة لإنشاء عاصبة وعائية تساعد على منع فقدان الدم المفرط أثناء القسطرة. بعد ذلك ، قم بعمل شق صغير في الشريان الفخذي باستخدام مقص زنبركي ، حيث سيتم إدخال القسطرة لاحقا لمراقبة المعلمات الفسيولوجية للفأر. في هذا الإجراء ، قم بإزالة الجلد الموجود على الفخذ الأيسر الإنسي للفأر.
بعد ذلك ، حدد موقع الوريد الفخذي. باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد وإبرة قياس 30 ، ارسم 130 ميكرولترا من محلول صبغة الفلورسنت. حقن 100 ميكرولتر من الصبغة ببطء في الوريد الفخذي.
بعد إزالة الإبرة ، ضع ضغطا لطيفا ثابتا على موقع الحقن لوقف أي نزيف والسماح للصبغة بالدوران لمدة خمس دقائق. ثم أغلق موقع الجراحة بالغرز. اقلب الماوس بحذر على بطنه وضعه في حزام لوحة رأس الماوس.
بالنسبة لتصوير الفوتون في الجسم الحي ، انقل الجهاز الجراحي إلى مجهر الفوتون وتأكد من الحفاظ على مستوى تخدير. بعد ذلك ، ضع كمية صغيرة من محلول ملحي بنسبة 0.9٪ في خزان لوحة الرأس وهدف المجهر السفلي بحيث يتلامس مع المحلول الملحي. بعد ذلك، حدد موقع منطقة الاهتمام باستخدام هدف عرض المجال الساطع.
بعد ذلك ، ابدأ تصوير الفوتونين. حدد موقع سرير شعري على شاشة العرض وقم بتكبير هذه المنطقة باستخدام التكبير/التصغير البصري أيضا. احصل على صور للشعيرات الدموية باستخدام برنامجي تصوير الفوتون.
لتصوير الفوتون خارج الجسم الحي ، قم بعمل شق في فروة الرأس من العظام الجدارية إلى العظام الأمامية للفأر المقطوع الرأس. قم بتثبيت الجلد على جانبي الجمجمة بإصبع السبابة والإبهام ، ضع المقص الدقيق للغاية أسفل العظم الجداري الإنسي وقم بقص الجمجمة على طول الخيط السهمي حتى حوالي ثلاثة ملليمترات بعد نقطة بريجما. بعد ذلك ، افصل الجمجمة عن الدماغ وقم بإزالة أي سحايا بعناية من سطح الدماغ باستخدام الملقط.
حرك الملقط برفق تحت الدماغ لتحريره من الجمجمة. بعد ذلك ، ضع الدماغ في مصفوفة دماغية خاصة بالفئران واغسله بقطرات من ACSF. بعد ذلك ، قم بإزالة قسم الدماغ الإكليلي بسمك ملليمتر.
ضع قسم الدماغ على شريحة زجاجية مقعرة تحتوي على ACSF ، بحيث يكون الجزء الأمامي من القسم متجها لأعلى. ثم قم بتغطية شريحة الدماغ برفق بقلة غطاء زجاجي. انقل الشريحة إلى مرحلة المجهر وضع كمية صغيرة من 0.9٪ محلول ملحي على زلة الغطاء.
اخفض هدف المجهر حتى يتلامس مع المحلول الملحي. بعد ذلك ، حدد موقع خط الوسط للدماغ باستخدام هدف المجال الساطع. الآن ، ابدأ تصوير الفوتون ، وحدد موقع خط الوسط مرة أخرى باستخدام هدف 25x.
أنجز ذلك من خلال البحث عن الشق الطولي على السطح القشري للقسم الإكليلي. بعد ذلك ، ضع الحافة اليمنى لشاشة التصوير على خط المنتصف وحرك شاشة العارض بشكل جانبي على ثلاثة إطارات كاملة. حدد العمق الذي تكون فيه الشعيرات الدموية بالكاد مرئية على شاشة العرض.
بعد ذلك ، قم بخفض مستوى التركيز البؤري لمدة 20 ميكرومتر إضافي لتحديد الجزء العلوي من z-stack. اضبط سمك الصورة على ميكرومتر واحد. قم بخفض شاشة العرض لمدة 100 ميكرومتر واضبط طاقة الليزر في جميع أنحاء بحيث يكون أقل من واحد بالمائة من وحدات البكسل مشبعة بشكل مفرط.
أخيرا ، احصل على z-stack. في هذا الشكل ، بعد تحضير شريحة الدماغ ، توجد منطقة تصوير على بعد حوالي 1.5 ملم من خط الوسط. ينتج مكدس z 100 ميكرومتر صورة ثلاثية الأبعاد تستخدم للتحليل في برنامج أميرة التحليلي.
ثم يتم تتبع الشبكة الشعرية يدويا عن طريق وضع العقد في بداية ونهاية الشعيرات الدموية أو أي مكان تتفرع فيه الشعيرات الدموية إلى أخرى. ينتج عن هذا صورة هيكلية بالكامل يتم استخراج المعلمات المورفولوجية منها تلقائيا. يمكن استخراج عدد العقد الشعرية والأجزاء ومتوسط طول المقطع وطول المقطع الكلي باستخدام تصويرين من الفوتون خارج الجسم الحي لشرائح دماغ الفأر.
هنا ، يتم إنتاج صورة ثنائية الأبعاد للشبكات الشعرية عن طريق التصوير في الجسم الحي ، حيث يمكن استخراج القطر الشعري ويمكن حساب الحجم الكلي للشعرية باستخدام القطر الشعري وطول المقطع الكلي الذي تم الحصول عليه من التصوير خارج الجسم الحي. بمجرد إتقانه ، يمكن إكمال هذا الإجراء في غضون ثلاث ساعات ونصف إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. أثناء إجراء هذا الإجراء ، من المهم التحرك بسرعة مع الحفاظ على مستوى ثابت من التخدير لأن الأيزوفلوران يمكن أن يتسبب في توسع الأوعية الدموية في الشعيرات الدموية القشرية ، وبالتالي تحريف البيانات.
خلال هذا الإجراء ، يمكن الحصول على معلمات شعرية أخرى ، مثل سرعة خلايا الدم الحمراء أو تدفق خلايا الدم الحمراء ، والتي يمكن أن توفر فهما أعمق للتغيرات المسببة للأمراض التي تظهر في الاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية والأمراض التنكسية العصبية الأخرى. حظا سعيدا في تجاربك.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه الورقة طريقة يمكن من خلالها تحديد العمارة الوعائية في الدماغ باستخدام التصوير المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم وخارج الجسم. الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التغيرات في شبكات الشعيرات الدموية القشرية بعد التعرض المطول لسم فيروس نقص المناعة البشرية، تاتا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الأوعية الدموية
- الاضطرابات العصبية المعرفية
الخلفية
- تساعد هذه الطريقة في فحص التغيرات الرئيسية في شكل الشعيرات الدموية القشرية.
- قد تساهم في تطور الاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية.
- تتيح التقنية تحديدًا كميًا دقيقًا من الناحية الفسيولوجية لعدة معايير مورفولوجية للشعيرات الدموية.
- يمكن أيضًا تطبيقها على أمراض أخرى ذات تغيرات وعائية، مثل مرض الزهايمر.
هدف الدراسة
- تحديد التغيرات في شبكات الشعيرات الدموية القشرية.
- تحقيقًا لآثار سم فيروس نقص المناعة البشرية، تاتا، على شكل الشعيرات الدموية.
- توفير رؤى حول تطور الاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية.
الطرق المستخدمة
- التصوير المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم وخارج الجسم.
- تطبيق هلام الدموع الاصطناعي على عيون الفئران المخدرة.
- تحديد معايير مورفولوجية للشعيرات الدموية كميًا.
- تحليل شبكات الشعيرات الدموية القشرية.
النتائج الرئيسية
- تحقق تحديد كمي دقيق من الناحية الفسيولوجية لمعايير الشعيرات الدموية.
- تم ملاحظة تغييرات كبيرة في شكل الشعيرات الدموية بعد التعرض لسم فيروس نقص المناعة البشرية.
- وفرت الطريقة رؤى حول التغيرات الوعائية المرتبطة بالاضطرابات العصبية المعرفية.
- تمت الإشارة إلى قابلية التطبيق المحتملة على أمراض أخرى.
الاستنتاجات
- الطريقة فعالة لدراسة العمارة الوعائية في الدماغ.
- يمكن أن تعزز الفهم للاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية لتشمل أمراض تنكس عصبي أخرى.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantifying cerebral vascular architecture provides mechanistic insights into neuroinflammatory disease models, supporting target validation in CNS drug discovery. This method enables preclinical assessment of vascular changes that may contribute to cognitive dysfunction, informing go/no-go decisions in neurodegenerative disease portfolios. By delivering physiologically accurate capillary morphometrics, it enhances predictive confidence in early-stage target de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses linking neuroinflammation to vascular rarefaction in HIV-associated neurocognitive disorders.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantification of capillary density, segment length, and network complexity.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying vascular-mediated mechanisms of cognitive decline.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline vascular phenotypes.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs including capillary node count, mean segment length, and total vascular length.
- Scalability: Enables platform reuse across disease models such as Alzheimer’s where vascular pathology is implicated.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance through direct measurement of cortical capillary alterations in a transgenic mouse model of HIV-1 Tat expression.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery to preclinical validation via consistent morphological readouts.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying vascular de-risking parameters.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for CNS-targeted therapeutics where vascular integrity is a mechanistic modifier.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neurovascular unit dysfunction and pathway clarification in neuroinflammatory models.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized z-stack acquisition and automated morphological parameter extraction.
- Analytics: Provides quantitative readouts such as capillary diameter, red blood cell flux, and volumetric flow for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via biomarker-aligned vascular metrics that predict cognitive outcomes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across neurodegenerative disease programs with vascular comorbidity.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence through mechanistic de-risking of vascular contributions to neurodegeneration.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility across in vivo and ex vivo imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk from unanticipated vascular toxicity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on vascular phenotype modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neurosurgical preparation, two-photon microscopy, and intravascular dye injection.
- Depends on two-photon laser scanning microscopes, head plate harnesses, and image analysis software such as Amira.
- Necessitates cross-team standardization between surgery, imaging, and analysis teams for consistent z-stack acquisition.
- Involves adaptation considerations when translating from mouse models to human-relevant vascular scaling.
- Limited by the technical skill required to maintain stable anesthesia without inducing vasoconstriction or vasodilation artifacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Preparation of the Thin-skull Cranial Window
2:41
Monitoring of Physiological Parameters
4:02
Injection of the Fluorescent Dye
4:54
In Vivo Two-Photon Imaging
5:42
Ex Vivo Two Photon Imaging
8:04
Results: Generation of Skeletonized Capillary Networks
9:17
Conclusion
![تصوير [كنفوكل] عالية الدقة لحاجز الدم في الدماغ: التصوير، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، والتقدير الكمي ترانسسيتوسيس](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56407.jpg%3Fv%3D2026-07-04T00%253A51%253A33.000Z&w=384&q=75)
