Bioprinting Cellularized التركيبات باستخدام الأنسجة محددة هيدروجيل Bioink

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إظهار نهج متعدد الاستخدامات لتصميم أحبار هيدروجيل حيوية يمكن بثقها من خلال أجهزة الطباعة الحيوية. يمكن بعد ذلك استخدام الأحبار الحيوية لتصنيع تركيبات الأنسجة ثلاثية الأبعاد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطباعة الحيوية ، مثل كيفية التحكم في الخواص الميكانيكية اللازمة لتوفير مادة يمكن بثقها باستخدام طابعة حيوية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا نستخدم المكونات المتوفرة تجاريا مجتمعة بطريقة معيارية لإنشاء حبر حيوي هيدروجيل بسيط وفعال قابل للطباعة الحيوية. تشمل تطبيقات هذه التقنيات إنشاء عضيات أنسجة ثلاثية الأبعاد يمكن استخدامها لنمذجة آثار الأدوية والسموم والأمراض بدقة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر إطارا للطباعة الحيوية لتركيبات الكبد ثلاثية الأبعاد ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنواع الأنسجة الأخرى مثل العضلات والرئة والقولون.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن هناك عددا من الكواشف المختلفة المستخدمة لإنشاء الحبر الحيوي الهيدروجيل ، ولكنه في الواقع بسيط تماما. سيظهر الإجراء Young-Joon Seol ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في فريقنا. للبدء ، قم بإعداد هضم مصفوفة خارج الخلية الخاص بالأنسجة لاستخدامه في تركيبة الهيدروجيل كما هو موضح في مكان آخر.

بعد ذلك ، قم بإذابة البادئ الضوئي في الماء بنسبة وزن لكل حجم تبلغ 0.1٪ لتشكيل أحبار الهيدروجيل الحيوية ، قم أولا بإذابة مكونات المواد الأساسية من مجموعات هيدروجيل حمض الهيالورونيك في حصص فردية من محلول البادئ الضوئي للماء. بعد ذلك ، اجمع بين محلول ECM ، وحمض الهيالورونيك الثيولي 2٪ ، والجيلاتين الثيولي 2٪ ، والروابط المتشابكة ، ووسائط زراعة خلايا الكبد بالنسب الموضحة هنا. لتحسين خصائص البثق للحبر الحيوي ، أضف 1.5 ملليغرام لكل ملليلتر من حمض الهيالورونيك غير المعدل و 30 ملليغرام لكل مليلتر من الجيلاتين إلى الخليط.

بعد ذلك ، قم بتدوير الخليط الناتج على حرارة عالية لمدة عشر ثوان قبل الاستخدام. قبل اختبار الحبر الحيوي في جهاز الطباعة الحيوية ، اختبر أولا خصائص البثق على مقعد المختبر. باستخدام حقنة قياسية ، قم بإسقاط عينة من الحبر الحيوي ثم قم بإرفاق إبرة قياس 20 إلى 30 بالمحقنة.

اسمح للحبر الحيوي بالتشابك ثم ادفع الحبر الحيوي عبر الإبرة لتحقيق خيوط هيدروجيل مقذوفة بسلاسة. إذا كانت التركيبة قادرة على إنشاء خيوط بها نتوءات قليلة أو معدومة ، فهي جاهزة للطباعة الحيوية. لتحميل مستحضرات الحبر الحيوي في طابعة حيوية ، قم بتحويل الأحبار الحيوية إلى خراطيش طابعة معقمة.

اسمح لهم بالجلوس لمدة 30 دقيقة قبل البثق حيث سيخضع الحبر الحيوي للمرحلة المتشابكة تلقائيا من المرحلة الأولى داخل الخرطوشة. بعد ذلك ، قم بتحميل الخرطوشة في إعداد الطباعة وقم بتوصيل مصدر ضغط هوائي بالخرطوشة. قم بإعداد نمط بسيط ، مثل هذه الشبكة التي يبلغ حجمها سبعة ملليمترات من الخطوط المتوازية ، للطباعة من أجل تقييم توافقها مع البثق.

بينما يتحرك رأس الطباعة في المستوى XY بسرعة 300 ملم في الدقيقة تقريبا ، قم بتطبيق ضغط قدره 20 كيلو باسكال على الخرطوشة لبثق الحبر الحيوي. إذا كانت المواد المبثوقة متكتلة أو غير منتظمة ، فقم بتقليل كمية الرابط المتقاطع المضافة من أجل تليين المرحلة الأولى من المواد المتشابكة. يجب أن تنبثق تركيبة الحبر الحيوي المعدة بشكل صحيح بسلاسة ، مما يسمح بالترسيب والبنى بدقة.

قم بإعداد كرويات الكبد ذات الخلايا الأولية ثلاثية الأبعاد في صفيحة 96 بئر باستخدام طريقة القطرة المعلقة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بعد ثلاثة أيام في الثقافة ، اجمع كرويات الكبد من صفيحة الإسقاط المعلقة باستخدام ماصة ، وانقلها إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل. دع الكرات تستقر في قاع الأنبوب المخروطي لمدة دقيقة إلى دقيقتين.

ثم ، قم بشفط الوسائط بعناية باستخدام ماصة. انقل 110 إلى 125 بالمائة من حجم البناء ثلاثي الأبعاد المطبوع المطلوب لمحلول الحبر الحيوي الهيدروجيل المحضر حديثا إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الكرويات. بعد ذلك ، قم بعمل ماصة الكرويات بعناية لأعلى ولأسفل لإعادة تعليقها في محلول الحبر الحيوي الهيدروجيل.

بمجرد تعليقه بالتساوي ، انقل المحلول الكروي إلى خرطوشة طابعة حيوية باستخدام ماصة واترك المحلول يخضع لمرحلة التشابك الأولى لمدة 30 دقيقة. بعد المرحلة من التشابك ، استخدم جهاز الطباعة الحيوية لإنشاء هياكل الهيدروجيل المرغوبة التي تحتوي على كرويات الكبد الأولية. بعد كل طبقة من الترسيب ، قم بتعريض الحبر الحيوي المطبوع لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة ثانيتين إلى أربع ثوان لبدء آلية التشابك الثانوية.

سيؤدي ذلك إلى استقرار التركيبات وزيادة الصلابة إلى المستوى المطلوب. تركيز ألكين PEG في المحلول هو ما يتحكم في كثافة التشابك الإجمالية ، وبالتالي يتحكم بشكل أساسي في صلابة البناء النهائي. بعد الطباعة الحيوية ، لوحظت قابلية عالية للخلايا في تركيبات الكبد باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.

في ظل الظروف البيئية المثلى ، يجب أن تكون الجدوى أعلى من 85٪ بالإضافة إلى ذلك ، عندما تم تلطيخ التركيبات لعلامات تدل على أنسجة الكبد ، لوحظ التعبير الإيجابي عن CYP3A4 ، وهو شكل إسوي سيتوكروم P450 ، وألبومين داخل الخلايا ، و E-cadherin ، وبروتين التصاق الخلية الظهارية ، و DPP4 ، وهو بروتين يتم التعبير عنه بشكل كبير في الكبد. عندما تم اختبار وسائط الاستزراع لمستويات اليوريا والألبومين ، وجد أن البناء يفرز كل من اليوريا والألبومين بمستويات ثابتة على مدار 14 يوما. يشير هذا أيضا إلى أن أحبار هيدروجيل الحيوية الخاصة بالأنسجة تساعد في الحفاظ على وظيفة خلايا الكبد.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي ساعتين من البداية إلى النهاية إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. ومع ذلك ، غالبا ما يعتمد هذا على جهاز الطباعة الحيوية المعين الذي يتم استخدامه. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الخطوات الموضحة يجب أن تتكيف في كثير من الأحيان لتكون متوافقة مع أنواع الأنسجة الأخرى أو أجهزة الطباعة الحيوية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إنشاء تركيبات أخرى من الحبر الحيوي الهيدروجيل من أجل دعم الطباعة الحيوية لأنواع الأنسجة الأخرى. ساعد تطوير هذه التقنيات في تمهيد الطريق لإنشاء منصات متعددة العضيات والجسم على رقاقة لفحص الأدوية ونمذجة الأمراض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية البدء في تصميم المواد التي يمكن استخدامها للطباعة الحيوية لتركيبات الأنسجة ثلاثية الأبعاد باستخدام التشابك متعدد الخطوات.

لا تنس أن العمل مع الأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يكون خطيرا للغاية على رؤية المرء ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام نظارات واقية من الأشعة فوق البنفسجية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.