تدفق نمط تلفيق إرشادية للعالي الكثافة الباركود الأجسام المضادة ميكروأري

الهدف العام من هذه المنهجية هو تصنيع مصفوفة أجسام مضادة مع تطبيقات في تحليل الخلية الواحدة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تحليل الخلية المفردة مثل كيف يمكننا اكتشاف البروتينات السرية والبروتينات داخل الخلايا في وقت واحد من نفس الخلية المفردة. وكيف يمكننا تصنيع منصة مصفوفة صغيرة لتحقيق هذا الهدف.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتخصيص. من خلال تغيير استراتيجيات نمط التدفق ، يمكن إنشاء مصفوفات ذات أبعاد مختلفة. مقدما ، قم بإنشاء SU-8 master لأنماط تدفق الباركود.

توفير التعليمات في بروتوكول النص. يتضمن ذلك تصميم وصنع قناع صور من الكروم. يوفر وضع القناع على طبقة مقاومة للضوء وتطبيق الأشعة فوق البنفسجية النمط.

لبدء تحضير قالب الباركود PDMS ، امزج 40 جراما من قاعدة المطاط الصناعي من السيليكون مع أربعة جرامات من عامل المعالجة ، ثم حركه بقوة لمدة 10 دقائق. ثم قم بإزالة الغاز من محلول البوليمر المسبق لمدة 20 دقيقة تحت الفراغ. بعد ذلك ، قم بتحميل المحلول في طبق بتري يحتوي على رقاقة من السيليكون مع سيد SU-8 لنمط الباركود.

صب المحلول على عمق 7.45 ملم. ثم قم بإزالة الغازات من الخليط في الطبق لإزالة أي فقاعات متبقية. اتبع إزالة الغازات عن طريق خبز الخليط لمدة ساعة على حرارة 75 درجة مئوية لعلاج PDMS.

بعد ذلك ، القطع بمشرط ، قم بإزالة قالب الباركود بعناية. ثم قشر البلاطة بعناية من الرقاقة. بعد ذلك ، قم بقص حواف البلاطة لعمل الشكل المطلوب للقالب.

قم بإنهاء القالب باستخدام ثقب خزعة مع مكبس لعمل ثقوب نصف ملليمتر في الميزات الدائرية على النمط والتي تمثل المداخل والمنافذ. بعد نفخ أي غبار من شريحة زجاجية مطلية ب poly-L-lysine بمسدس نفخ من النيتروجين ، قم بتوصيل قالب PDMS بالشريحة. قم بمحاذاة حواف القالب بعناية على الشريحة.

الآن ، اخبز التجميع لمدة 90 دقيقة عند 75 درجة مئوية لتقوية الرابطة بين PDMS والشريحة. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد 20 قطعة من أنابيب البولي إيثيلين المرنة للمداخل والمنافذ. على كل قطعة من الأنابيب ، قم بإرفاق دبوس مجوف من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر ملليمتر واحد.

ثم ، عبر المسامير ، املأ الأطوال بسنتيمتر أو أكثر من بولي إل ليسين. بمجرد ربطها بالزجاج ، اربط المسامير بعناية بمداخل القالب. هذه هي أصعب خطوة في التحضير.

لا تتسرع في العملية. قم بتوصيل الطرف الآخر من الأنابيب بإعداد خزان النيتروجين المنظم بالضغط والذي يتكون من شبكة من 20 صماما ثلاثي الاتجاهات ويمكنه التعامل مع قالبين في وقت واحد. باستخدام الإعداد ، قم بتفجير المحلول من خلال القالب عند 0.5 إلى PSI واحد لمدة ست ساعات على الأقل.

ابدأ بشفط محاليل الحمض النووي أحادية الشريطة المعدة حديثا في BS-3 من خلال دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ وفي أنابيب البولي إيثيلين. بعد ذلك ، قم بإقران قالب PDMS بمصدر النيتروجين وقم بتدفق المحلول عبر قالب الباركود لمدة 40 دقيقة تقريبا أو حتى تمتلئ جميع القنوات. ثم أوقف التدفق واترك القالب يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

بعد بضع ساعات ، اخبز قالب الباركود على حرارة 75 درجة مئوية لمدة ساعة. بمجرد خبزها ، افصل القالب عن الشريحة واغسل الشريحة برفق باستخدام 01٪ SDS. ثم اغسل الشريحة ثلاث مرات بماء فائق النقاء.

اتبع الغسالات عن طريق تجفيف شريحة الباركود باستخدام غزل منزلق. بمجرد أن يجف ، قم بتخزين شريحة الباركود في أنبوب نظيف سعة 50 مل. للمتابعة ، اتبع بروتوكول النص للتحقق من صحة النمط أحادي البعد.

لإجراء التحقق من الصحة ، قم بحظر الشريحة ، وتهجين السيانين ثلاثة حمض نووي تكميلي لها وقياس النتائج. يحتوي سيد SU-8 لمصفوفة ثلاثة في ثلاثة على نمط تدفق عمودي على نمط التصميم الأول. استخدم الطريقة الموضحة سابقا لإنشاء قالب PDMS جديد لهذا النمط.

للبدء ، قم بعمل تركيزات عمل جديدة من قليل النوكليوتيدات التسعة. الآن ، قم بتدفق حل حظر BSA بنسبة ثلاثة بالمائة في جميع القنوات ال 20 لشريحة المصفوفة لمدة ساعة عند 0.5 إلى رطل لكل بوصة مربعة واحدة. بعد ذلك ، قم بتحميل حلول الحمض النووي في القنوات الخاصة بها.

بعد تدفقها لمدة 40 دقيقة تقريبا ، احتضن الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين للسماح للحمض النووي بالتهجين. بعد ذلك ، قم بتدفق محلول حجب BSA بنسبة ثلاثة بالمائة في جميع القنوات ال 20 لمدة ساعة. سيؤدي ذلك إلى إزالة الحمض النووي غير المهجن.

الآن ، قم بتقشير شريحة المصفوفة من PDMS وقم بغمس الشريحة في ثلاثة بالمائة BSA مرة واحدة. بعد ذلك ، قم بغمس الشريحة في PBS مرتين متبوعة بانخفاض واحد في اثنين بالمائة من PBS. ثم ، كما كان من قبل ، جفف الشريحة باستخدام دوار الشريحة المجهرية.

للمتابعة، قم بتنفيذ خطوة التحقق من الصحة المشابهة للتحقق من صحة الشرائح أحادية البعد. استخدم قليل النوكليوتيدات من واحد إلى تسعة أولي ، وكلها مترافقة مع السيانين ثلاثة. احفظ شريحة المصفوفة ثلاثة في ثلاثة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر للاستخدام اللاحق.

يشرح بروتوكول النص أيضا كيفية تحويل مصفوفة الحمض النووي إلى مصفوفة أجسام مضادة. بعد تحضير وتنقية مترافقات الجسم المضاد oligo ، قم بإعداد قالب PDMS آخر بغرف دقيقة. انظر النص للحصول على التفاصيل.

قم بتزاوج هذا القالب مع شريحة المصفوفة. الآن ، قم بحظر الشريحة باستخدام واحد بالمائة من BSA واحتضانها لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد 200 لتر ميكرو من متقارنات الأجسام المضادة قليلة النوكليوتيدات.

بعد الكتلة ، أضف كوكتيل الأجسام المضادة إلى الإعداد. دع الأجسام المضادة تحتضن على المصفوفة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية ، ثم قم بتنظيف الشريحة وجففها قبل الشروع في انخفاضات الشرائح الموضحة في بروتوكول النص. بعد اتباع البروتوكول الموصوف ، باستخدام مجموعة ثلاثة في ثلاثة ، تم استخدام لوحة الأجسام المضادة الناتجة في الكشف عن الإرسال المتعدد ، بشكل أساسي من خلال منصة شطيرة ELISA.

أظهرت البروتينات أقل من 10٪ تباينا من طرف إلى الطرف الآخر من الشريحة الزجاجية. في المصفوفة ثلاثة في ثلاثة ، يمكن اكتشاف ما يصل إلى سبعة بروتينات جنبا إلى جنب مع مرجع مسمى السيانين ثلاثة وعنصر تحكم سلبي. في تجربة أحادية الخلية أجريت لدراسة الورم ، تم اكتشاف جميع البروتينات الستة في وقت واحد.

للمعايرة ، تم تطبيق البروتينات المؤتلفة على مصفوفة بتركيزات مختلفة. كانت حساسية الكشف مشابهة تماما لشطيرة ELISA التقليدية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على قوالب PDMS خالية من الجسيمات.

يمكن أن يؤدي الغبار في القنوات إلى مصفوفات ذات توحيد ضعيف وحساسية منخفضة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث السرطان لاستكشاف إشارات الخلية الخلوية باستخدام نماذج البيئات الدقيقة للورم.