عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مجموعة بروتين معيارية لا تتطلب خطوة تنقية ، مما يجعلها متوافقة مع أي مكتبة بروتين. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد الجينات الاصطناعية أولا من خلال تجميع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بعد ذلك ، يتم ترتيب الجينات الاصطناعية على شرائح الايبوكسي.

لتصنيع جهاز الموائع الدقيقة ، استخدم PDMS مع التحكم في السيليكون وقوالب التدفق. ثم يتم محاذاة جهاز الموائع الدقيقة مع مجموعة الحمض النووي المرقطة. أخيرا ، يتم تدفق محللة الخلايا الشبكية للأرانب إلى جهاز الموائع الدقيقة ويتم التعبير عن البروتينات.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر التعبير عن آلاف البروتينات من خلال وضع العلامات على الأجسام المضادة الفلورية. هناك العديد من المزايا لاستخدام التقنية القائمة على الموائع الدقيقة على الطرق الحالية مثل المصفوفات الدقيقة للبروتين. نحن المصفوفات الدقيقة للحمض النووي ثم نستخدم cellis لصنع البروتينات على الجهاز.

وبالتالي ، لا نحتاج إلى تنقية البروتين والبروتينات لا تجف أبدا. تظل طازجة طوال التجربة. توفر تقنية الموائع الدقيقة أيضا حساسية أعلى لتصنيع جهاز الموائع الدقيقة ، قم بتعريض قوالب التحكم في السيليكون والتدفق لبخار ثلاثي ميثيل سيلين الكلورو لمدة 10 دقائق لتعزيز إطلاق المطاط الصناعي.

بعد خطوات الخبز ، قم بإعداد خليط من المطاط الصناعي القائم على السيليكون وعامل المعالجة بنسبتين مختلفتين من خمسة إلى واحد و 20 إلى واحد لقوالب التحكم والتدفق على التوالي. صب خمسة إلى واحد PDMS على طبقة التحكم. قم بإزالة طبقة التحكم واخبزها لمدة 30 دقيقة عند 80 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بتغطية خليط PDMS من 20 إلى واحد على طبقة التدفق عند 2 ، 600 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية ، ثم اخبزيه على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. افصل طبقة التحكم ببطء عن القالب ، مع الحرص على عدم تقشير نمط SU الثماني. ثم باستخدام مشرط ، قم بقص الجهاز حول محيطه واستخدم إبرة حادة لعمل ثقوب للوصول إلى قنوات التحكم تحت المجهر.

قم بمحاذاة طبقات التدفق والتحكم يدويا بدءا من الزاوية اليسرى العليا ووضع صمام الزر على طبقة التحكم في منتصف غرفة التفاعل. بعد ذلك ، قم بمحاذاة الصف الأول وحرر طبقة التحكم برفق صفا تلو الآخر. تأكد من أن جميع صمامات الأزرار في منتصف غرف التفاعل وأن صمامات العنوان والإدخال تعبر قنوات التدفق في الموضع الصحيح.

كرر العملية محليا حتى تتم محاذاة جميع الصفوف. عند المحاذاة الكاملة ، حرر أي توتر في نظام إدارة الرسومات عن طريق رفعه بعناية من الجانبين والزوايا. ثم اخبز الجهاز لمدة ساعتين عند 80 درجة مئوية بعد الخبز.

قم بقص المحيط وقشر الجهاز المكون من طبقتين من ثقوب قالب التدفق للوصول إلى قنوات التدفق لإنشاء تركيبات الحمض النووي للجهاز. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لإنتاج جينات اصطناعية تتكون من محفز T سبعة ، وموقع ربط الريبوسوم ، وإطار قراءة مفتوح مع علامات حاتمة مختلفة في كلا الطرفين وفاصل T السبعة. لتحضير الجينات الاصطناعية للصفيف ، اصنع مزيجا من البولي إيثيلين جلايكول وثنائي هيدرات D triose توزيع ميكرولترين لكل تفاعل في آبار 384.

لوحة حسنا. أضف الجينات الاصطناعية إلى صفيحة 384 بئر. ثم أضف الماء المقطر إلى الحجم النهائي البالغ 20 ميكرولترا.

بعد ذلك ، باستخدام بقعة المصفوفة الدقيقة ، سلسلة من الجينات الاصطناعية على ركائز زجاجية مطلية بالإيبوكسي. تحت منظار مجسم ، قم بمحاذاة جهاز الموائع الدقيقة يدويا مع مصفوفة الجينات مع بقعة الحمض النووي الموضوعة في منتصف غرف الحمض النووي. ثم قم بتجميع بقية الصفوف.

الانتهاء من الضبط الدقيق للجهاز بالكامل لتخفيف أي ضغط على PDMS والتأكد من ارتباطه جيدا بالمصفوفة الدقيقة. ارفعه محليا. أخيرا ، قم بربط الجهاز بالشريحة الزجاجية عن طريق احتضانه طوال الليل على لوح ساخن عند 80 درجة مئوية.

تستخدم أصباغ الطعام في هذا القسم لأغراض التصور. يتم تشغيل الصمامات الموجودة في طبقة التحكم من الكمبيوتر باستخدام عرض المختبر. يتحكم البرنامج النصي لعرض المختبر في سلسلة من صمامات الملف اللولبي الدقيقة عبر صندوق تحكم إلكتروني.

توصيل مشعب صمام الملف اللولبي بالهواء المضغوط ، والذي يتحكم في تدفق الهواء والضغط إلى صمامات التحكم على الجهاز. باستخدام أنبوب بلاستيكي مرن بقطر داخلي يبلغ 0.02 بوصة ودبوس من الفولاذ المقاوم للصدأ ، قم بتوصيل الجهاز بمشعب صمامات الملف اللولبي. املأ الأنابيب بالماء المقطر المزدوج وأدخل الدبوس في فتحات الوصول لطبقة التحكم.

تأكد من توصيل كل أنبوب بقناة التحكم المقابلة له. لتنشيط قنوات التحكم ، قم بتشغيل تطبيق عرض المختبر ، واضبط ضغط الهواء على خمسة حصان. ثم أقوم بتطبيق ضغط الهواء عن طريق تنشيط الصمام من البرنامج النصي لعرض المختبر. سيؤدي ذلك إلى دفع الماء إلى قنوات التحكم PDMS لتحديد الحديث المتبادل المحتمل بين قنوات التحكم في الأجهزة المعيبة.

املأ الساندويتش وصمامات العنوان أولا. بعد كل شيء ، قنوات التحكم والصمامات مليئة بالماء ، قم بتجهيز الصمامات لمنع قنوات التدفق تحتها. عن طريق زيادة ضغط الهواء أولا إلى 15 رطل لكل بوصة مربعة ثم في برنامج عرض المختبر من خلال مجموعة من مفاتيح التشغيل المتصلة بصمامات الملف اللولبي الفردية.

قم بتنشيط جميع الصمامات عن طريق تشغيل جميع أزرار التبديل للتأكد من أن جميع الصمامات مفتوحة. قم بتوصيل أنبوب بأحد مدخلات التدفق ، وعند أربعة إلى خمسة رطل لكل بوصة مربعة يتدفق الهواء إلى الجهاز. سيؤدي ذلك إلى تحرير أي صمامات لاصقة من الشريحة الزجاجية.

الجهاز الآن جاهز وجاهز لأغراض التصور. تستخدم صبغة الطعام الصفراء لتصور الكواشف في هذا القسم ويمثل المحلول عديم اللون الهيبيين لتسهيل التجميع الذاتي لمجموعة البروتين على السطح ومنع الامتصاص غير المحدد داخل جهاز الموائع الدقيقة ، وتعديل السطح كيميائيا عن طريق توصيل أنبوب جديد بالمحلول المطلوب أولا بإحدى قنوات التدفق في الجهاز. ثم قم بتوصيل الجانب الحر من الأنبوب بالمشعب اليدوي وافتح تدفق ضغط الهواء.

قم بتحميل 40 ميكرولترا من البيوتين المبتهج BSA في أنبوب جديد وقم بتدفق نصفها تقريبا عبر الجهاز لمدة 20 دقيقة. استخدم 50 مللي مولار من الهيبيز لغسل أي ركيزة غير متفاعلة بين كل خطوة من الخطوة. بعد ذلك ، قم بتدفق 25 ميكرولتر من الستربتافيدين لمدة 20 دقيقة.

في الجزء العلوي من البيوتين المبتهج BSA ، اغسل مع hees لمدة خمس دقائق لأكل السطح المحيط بالزر ، وأغلق صمام الزر وتدفق باقي BSA البيوتينيل ، ثم اغسله بالبازلاء مرة أخرى لمدة خمس دقائق. أخيرا ، لإنشاء مصفوفة علامة مضادة للهسهسة أسفل الزر ، حرر صمام الزر وقم بتدفق 30 ميكرولترا من البيوتين Penta هسهسة لمدة 20 دقيقة لإنشاء مجموعة من البروتينات على الجهاز. افتح صمامات الرقبة وتدفق الخلايا الشبكية للأرانب.

تفاعل النسخ والترجمة المقترن السريع من خلال الجهاز إلى غرفة الحمض النووي. بعد ذلك ، أغلق الصمامات العازلة لفصل كل جين عن بيئته واحتضان الجهاز على لوح ساخن لمدة 2.5 ساعة عند 30 درجة مئوية. ثم قم بتسمية الطرف النهائي للبروتينات بالجسم المضاد الثالث SI mix C.

أخيرا ، باستخدام ماسح ضوئي للمصفوفة الدقيقة مع ليزر 532 نانومتر ومرشح انبعاث 575 نانومتر. تحديد مستويات البروتين. يوضح هذا الشكل المستويات المتفاوتة لتعبير البروتين على مصفوفة البروتين.

عادة ما تفشل 20٪ من مكتبة الجينات في التعبير عن مستويات يمكن اكتشافها. تم تحديد مستويات الخلفية باستخدام الغرف التي لم يتم رصدها بالحمض النووي. وبالتالي ، فإن الإشارات من غرف البروتين المقابلة ترجع إما إلى الضوضاء أو الامتصاص غير المحدد للأجسام المضادة لوضع العلامات.

إذا تم إجراؤها بشكل صحيح، فسيستغرق التحقق من الجهاز أربع ساعات وتستغرق تجربة الشريحة خمس ساعات.