طريقة سريعة وفعالة لتنقية خلايا الأديم المولدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

الهدف العام من هذه الطريقة هو تنقية الخلايا الأديم الباطني الناتجة عن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو خلايا ES. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الخلايا الجذعية حول التمايز الأديمي الباطني. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية الحصول على مجموعة نقية من خلايا الأديم الباطني بعد إزالة الخلايا غير المتمايزة.

قبل البدء في الإجراء، قم بطلاء أطباق زراعة خلايا مكونة من ستة آبار باستخدام 1 mL من مصفوفة الغشاء القاعدي لكل بئر، وذلك لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، ولحصد خلايا ES البشرية، قم بسحب الوسط من مزرعة خلايا جذعية جنينية بشرية وصلت نسبة تلاقيها إلى 80 إلى 90% باستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة.

ثم تُغسل الخلايا باستخدام 2 mL من PBS لكل بئر، مع هز الطبق وسحب المحلول الملحى لإزالة الخلايا الميتة والحطام. بعد ذلك، يتم تفكيك تجمعات الخلايا بلطف باستخدام 1 mL من محلول نقل الخلايا الخالي من الإنزيمات، عند درجة حرارة 37 °C و5% carbon dioxide حتى تظهر على الخلايا علامات واضحة للتفكك إلى تجمعات أصغر.

بعد مرور حوالي سبع دقائق، أضف 1 mL من وسط DMMF12 إلى الآبار. ثم قم بعملية السحب والدفع (pipette up and down) عدة مرات باستخدام طرف ماصة سعة 1 mL لفصل تجمعات الخلايا المتبقية وتحويلها إلى معلق خلوي أحادي. وباستخدام الماصة ذاتها، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي واغسل الآبار بـ 1 mL من وسط DMMF12 الطازج، مع تجميع نواتج الغسل في الأنبوب.

بعد تدوير الخلايا لترسيبها، أعد تعليق الراسب في خمسة ملليلتر من وسط استزراع خلايا ES المكمل بمثبط ROCK. قم بعد الخلايا وزرع 1.5-4 × 10⁵ خلية لكل بئر في أطباق مطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي في وسط استزراع مكمل بمثبط ROCK لمنع الموت الخلوي المبرمج. قم بتحضين الخلايا لمدة 24 ساعة تقريبًا.

ثم استخدم ماصة باستور زجاجية معقمة لاستبدال الوسط في كل بئر بـ 2 milliliters من وسط تحريض الخط البدائي. وبعد 24 ساعة أخرى من الزراعة، استبدل الوسط بوسط تحريض الأديم الباطن لفترة حضانة مدتها 48 hour مع تغيير الوسط يومياً. وفي اليوم الأخير من الزراعة، وقبل ساعة واحدة على الأقل من حصاد الخلايا، أضف مثبط ROCK طازج إلى وسط الزراعة.

استخدم بعد ذلك ماصة باستور زجاجية معقمة لسحب الوسط من كل بئر، وقم بتفكيك الخلايا باستخدام كاشف محلول نقل خالٍ من الإنزيمات كما تم توضيحه للتو. وعند الوصول إلى معلق خلوي أحادي، قم بعد الخلايا وطردها مركزياً. تأكد من أن جميع الأوساط والمحاليل المنظمة تحتوي من هذه النقطة فصاعداً على مثبط ROCK لمنع موت الخلايا.

وإلا، فلن تلتصق الخلايا بشكل صحيح بعد تراجع السائل. أعد تعليق الراسب في 100 µL من Buffer PEB، مضافاً إليه مثبط ROCK لكل 1 × 10⁷ خلية. ثم أضف جسم مضاد CXCR4 APC إلى الخلايا.

قم بنقر الأنبوب برفق للمزج. بعد مرور 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 degrees Celsius، اغسل الخلايا في 1 إلى 2 milliliters من منظم PEB buffer واستخدم ماصة باستور زجاجية معقمة لسحب السائل الطافي. أعد تعليق الراسب في 80 µL من منظم PEB buffer لكل 1 × 10⁷ خلية وأضف 20 µL من خرزات anti-APC الدقيقة إلى الخلايا.

امزج العينة عن طريق النقر الخفيف. ثم قم بتحضين الخلايا عند درجة حرارة 4 °C لمدة 15 دقيقة. وفي نهاية فترة التحضين، اغسل الخلايا باستخدام 1 إلى 2 mL من منظم PEB buffer المدعم بمثبط ROCK.

ثم أعد تعليق الراسب في 500 µL من منظم PEB الطازج مضافاً إليه المثبط. لعزل الخلايا CXCR4+ عن طريق الفصل بالخرز المغناطيسي، قم بتحميل عمود مغناطيسي متوسط الحجم على مغناطيس مناسب الحجم واغسل العمود مسبقاً بـ 500 µL من منظم PEB مضافاً إليه ROCK inhibitor. وعندما يتم تصريف كل سائل الغسيل من أعلى العمود، أضف كامل حجم الخلايا المسمى بالخرز المغناطيسي إلى العمود، مع تجميع السائل المار في أنبوب مخروطي.

اغسل العمود بثلاث تطبيقات من 500 µL من منظم PEB مضافاً إليه ROCK inhibitor. ثم انقل العمود من المغناطيس إلى أنبوب تجميع مناسب. ومرر 1 mL من منظم PEB مضافاً إليه ROCK inhibitor عبر العمود لتجميع خلايا +CXCR4.

اختياريًا، يمكن جمع جميع عينات التدفق المار بشكل منفصل، واستخدام حصص مقدارها 20 µL من كل عينة لتحديد نسبة الخلايا CXCR4+ في كل حصة عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن تكرار هذا الإجراء مع التدفق المار الأول لجمع الخلايا التي لم ترتبط بالعمود. بعد ذلك، يتم تجميع كافة عينات CXCR4+ المقسمة وطردها مركزياً.

أخيرًا، أعد تعليق الراسب في 1 mL من وسط تحفيز الأديم الباطن المدعم بـ ROCK inhibitor، ثم ازرع الخلايا بالكثافة المناسبة في وعاء زراعة خلايا مغطى بمصفوفة الغشاء القاعدي. قبل تمايزها، تعبر خلايا ES البشرية عن مستويات عالية من علامة تعدد القدرات SOX2، بينما لا يتم الكشف عن علامة الأديم الباطن النهائي FOXA2.

عند التمايز، تخضع خلايا ES لتغيرات جذرية في التعبير الجيني والبروتيني. وبالفعل، بعد أربعة أيام في وسط التمايز، يتم التعبير المشترك عن SOX17 و FOXA2 بشكل موحد داخل نوى العديد من خلايا ES السابقة، وهو ما يعد علامة مميزة للالتزام بالطبقة الداخلية النهائية.

وفي الواقع، يحتفظون بتعبير علامة تعدد القدرات SOX2. وفي هذه التجربة التمثيلية، في اليوم الثالث من التمايز، عبرت ما يقرب من 60% من خلايا ES التي تم حصادها عن CXCR4، وقد تم إثراء نقائها إلى أكثر من 85% بعد فرز الخلايا متعددة القدرات وسلالات الخلايا غير المرغوب فيها الأخرى باستخدام الكرات المغناطيسية. وبعد زراعة خلايا CXCR4+ المنقاة، تم اكتشاف عدد قليل فقط من خلايا SOX2+، بينما عبرت غالبية الخلايا المزروعة عن FOXA2.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون ساعتين، إذا نُفذت بشكل صحيح. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء فحوصات أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية أو QPCR للإجابة على أسئلة إضافية حول عملية التمايز. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية خلايا الأديم الباطن عن طريق الفرز بالخرزات المغناطيسية.