المجهر من دورة حياة الجنسية الانشطار الخميرة

الهدف العام من هذه الطريقة هو مراقبة عملية التكاثر الجنسي بأكملها في الخميرة الانشطارية بواسطة الفحص المجهري الضوئي. تصف هذه الطريقة تحضير خلايا الخميرة الانشطارية للتصوير بفاصل زمني لمراحل مختلفة من دورة الحياة الجنسية ، مثل اختيار شريك التزاوج ، والنمو المستقطب ، واندماج الخلايا الخلوية ، والعضل ، والتبواغ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر تصورا أحادي الخلية وبالتالي تتغلب على مشكلة عدم دخول الخلايا في التمايز الجنسي بشكل متزامن.

هذه الطريقة بسيطة للغاية ، لكن العرض التوضيحي المفيد لإظهار كيفية تركيب عدة سلالات بالتوازي للفحص المجهري. ستظهر الإجراء مع طالبة الدكتوراه أومايا دودين ، لورا ميرليني ، باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبري. هناك العديد من الاختلافات في هذا البروتوكول والتي يمكن تخصيصها لدراسة مراحل مختلفة من دورة الحياة الجنسية ، باستخدام سلالات متجانسة أو غير متجانسة.

في هذا العرض التوضيحي ، سيتم استخدام سلالات H90 المتجانسة. في هذه السلالات ، يحدث تبديل نوع التزاوج أثناء الانقسام الانقسامي الأخير بعد الحرمان من النيتروجين ، مما ينتج عنه مزيج من نوعي التزاوج. في المساء ، قبل يومين من تجربة التزاوج ، قم بتلقيح السلالات المخططة حديثا من الوسائط الصلبة في أنابيب الاستزراع التي تحتوي على 3 ملليلتر من الحد الأدنى من وسط التبوغ بالنيتروجين أو MSL بالإضافة إلى N.احتضان طوال الليل مع الاهتزاز عند 25 درجة مئوية.

في صباح اليوم التالي ، إذا لزم الأمر ، قم بتخفيف معلقات الخلية في MSL plus N لضمان النمو الأسي على مدار اليوم. في المساء ، قم بقياس الكثافة البصرية وتخفيف الخلايا في 20 مل من وسائط MSL plus N في قوارير 100 ملليلتر إلى كثافة بصرية تبلغ 025 يجب أن تصل مزارع الخلايا من النوع البري إلى كثافة بصرية 600 من حوالي 8 في صباح اليوم التالي. لذلك يجب تعديل التخفيف وفقا لذلك ، إذا كنت تعمل مع سلالات ذات أوقات توليد أطول.

احتضان الثقافات بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية مع الرج. في صباح اليوم التالي ، قم بقياس الكثافة الضوئية للتحقق من أن كل ثقافة لها كثافة بصرية 600 حوالي 8. بيليه الخلايا عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة ونقلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر.

اغسل الخلايا ثلاث مرات في 1 مليلتر من الحد الأدنى من وسط التبوغ بدون نيتروجين أو MSL ناقص N.بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق الخلايا في 3 ملليلتر من MSL ناقص N متوسط. قم بقياس الكثافة الضوئية وتخفيف الخلايا إلى كثافة بصرية 600 من 1.5. لبدء تحضير وسادات الاغاروز ، قم أولا بإذابة Aliquat من MSL ناقص N agarose 2 في المائة في كتلة حرارية 95 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة.

في غضون ذلك ، تم تحضير الحبيبات 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في وقت سابق عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في المتبقية من 2 إلى 4 ميكرولتر من المتوسط. مع انتظار الخلايا على المقعد ، أضف 200 ميكرولتر من الوسط المنصهر على شريحة زجاجية بين فواصل.

ضع شريحة أخرى برفق فوق الأجار المذاب. بمجرد أن تصلب الاغاروز ، قم بإزالة الفواصل بعناية. لإزالة الشريحة الزجاجية العلوية ، قم بتدويرها برفق واسحبها جانبيا.

إذا تم تصوير عدة سلالات في وقت واحد ، فيمكن تقسيم الوسادة إلى أربع وسادات صغيرة. لهذا ، استخدم شفرة حلاقة وقم بتقسيم الوسادة في منتصفها ، واسحب الأجزاء جانبا حوالي 1 ملليمتر وكرر ذلك في الاتجاه العمودي. أضف 1 ميكرولتر من الخلايا إلى وسادة الاغاروز وانتظر لمدة دقيقة واحدة.

قم بتغطية الخلايا بزلة غطاء وأغلق محيط زلة الغطاء بالكامل باستخدام VELAP ساخن. من المهم إغلاق زلة الغطاء بالكامل لمنع جفاف الوسادة. اترك الوسادة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التصوير.

لضمان نجاح البروتوكول ، وكفاءة التزاوج العالية ، يجب الاحتفاظ بالخلايا في نمو أسي حتى تجويع النيتروجين وتركيبها بدون سائل زائد بحيث تكون ثابتة على وسادة الاغاروز. ثم يتم إجراء تصوير الخلايا الحية لخلايا الخميرة التزاوجية عند 25 درجة مئوية ، أو درجة حرارة الغرفة ، باتباع الإجراء الموضح في نص البروتوكول. يسمح التصوير بفاصل زمني بتصور الخلايا التي تخضع للانصهار والاندماج والتبواغ في ال 24 ساعة التي تلي تجويع النيتروجين.

يتم توضيح هذه العملية في هذا الفيلم التمثيلي من خلال الخليتين المكبرتين في الجزء السفلي الأيسر. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لمراقبة ديناميكيات البروتينات الموسومة بالفلورسنت في خلايا التزاوج. هنا ، تم تزاوج سلالة H غير المتجانسة التي تعبر عن myo52 الموسومة ب 3GFP مع سلالة H + غير متجانسة تعبر عن myo52 مدمجة في بروتين tdTomato الفلوري الأحمر ، بالإضافة إلى GFP العصاري الخلوي.

يسمح GFP العصاري الخلوي بمراقبة توقيت الاندماج ، والذي يتصوره من خلال دخوله إلى الخلية H. تظهر صور الفاصل الزمني هذه أن myo52 تشكل في البداية إلى مناطق ديناميكية في جميع أنحاء قشرة الخلية. ثم استقرت إشارة Myo52 في تركيز واحد قبل حدث الاندماج مباشرة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الخلايا للتزاوج الفعال والتحقيق في الخلايا الحية لعملية التزاوج للخميرة الانشطارية.