تحديد MyoD Interactome عن طريق جنبا الى جنب الانجذاب تنقية جانب لقياس الطيف الكتلي

الهدف العام من هذه التجربة هو توصيف شركاء بروتين MyoD بشكل شامل. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا العضلات الهيكلية مثل التنظيم الجزيئي للتشوه اللوني للعضلات الهيكلية بواسطة عامل نسخ العضلات الرئيسي ، MyoD. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بالكشف عن شركاء MyoD الذين لديهم وفرة منخفضة اختياريا ، أحدهم مترجم في حجرة واحدة دون نووية محددة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتنظيم تمايز العضلات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل أي أنسجة أخرى ، وتحديدا التمايز النووي. سيوضح الإجراء الدكتور لوريان فريتش ، مساعد باحث من مختبرنا. في هذا البروتوكول ، سيتم تنقية مجمعات MyoD من خلايا HeLa S3 التي تعبر بثبات عن MyoD باستخدام علامات FLAG glutenin.

سيتم استخدام خلايا HeLa S3 المنقولة مع المتجه الفارغ كعنصر تحكم. تم زراعة كلا خطي الخلايا مسبقا وجمعهما وتخزينهما عند سالب 80 درجة مئوية ، كما هو موضح في نص البروتوكول. بسرعة, قم بإذابة كريات الخلية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.

يجب تبريد جميع المخازن المؤقتة والمجانسات مسبقا ويجب تنفيذ هذا الإجراء بأكمله في غرفة باردة. عادة ، يتم استخدام 20 جراما من الخلايا لكل نقطة تجريبية ، ولكن لأغراض هذا العرض التوضيحي ، ستتم معالجة 10 جرامات فقط ، أو حوالي 10 مل من الخلايا. أعد تعليق الخلايا في 10 مل من المخزن المؤقت منخفض التوتر A ، باستخدام 5 مل من المخزن المؤقت في البداية.

ثم إضافة 2.5 مل ، متبوعا ب 2.5 مل أخرى. اغسل الماصة جيدا بمخزن مؤقت جديد للحصول على أقصى عدد ممكن من الخلايا. انقل 20 مل من تعليق الخلية إلى الخالط المبرد مسبقا باستخدام مدقة محكمة الغلق.

تجانس الخلايا مع 20 ضربة. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 50 مل. لتحقيق أقصى قدر من التعافي للخلايا ، اغسل الخالط ب 3.5 مل من السكروز العازلة.

انقل هذا المعلق بسرعة إلى أنبوب سعة 50 مل للحفاظ على النوى والحد من التسرب. قم بتلطيخ 30 ميكرولتر من تعليق الخلية ب 30 ميكرولتر من 4٪ Trypan Blue وقم بتحليلها تحت المجهر لتحديد كفاءة التحلل. يجب أن تكون جميع النوى زرقاء إذا نجح التحلل.

إذا لزم الأمر ، كرر التجانس. جهاز طرد مركزي لمدة سبع دقائق عند 10،000 × جم وأربع درجات مئوية لحبيبات النوى. احفظ المادة الطافية كجزء سيتوبلازمي.

ابدأ إجراء تحضير الجزء القابل لاستخراج الملح النووي عن طريق إعادة تعليق حبيبات النوى في 4 مل من محلول السكروز. بعد ذلك ، أضف 4 مل من المحلول العالي الملح قطرة قطرة أثناء الخلط جيدا على دوامة للحصول على تركيز نهائي يبلغ 300 ملي مولار من كلوريد الصوديوم. احتضن لمدة 30 دقيقة على الثلج مع الخلط كل خمس دقائق.

بعد ذلك ، قلل تركيز كلوريد الصوديوم إلى 150 ملي مولار عن طريق إضافة 8 مل من السكروز المؤقت. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 13،000 × جم وأربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية وهي الجزء القابل لاستخراج الملح واتركه على الجليد.

لتحضير الجزء المرتبط بالكروماتين ، أعد تعليق الحبيبات بدقة في 3.5 مل من السكروز العازل. أضف كلوريد الكالسيوم إلى التركيز النهائي البالغ 1 ملي مولار واخلطه. سينشط كلوريد الكالسيوم نوكلياز المكورات الدقيقة التي ستتم إضافتها لاحقا.

سخن المعلق لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية. أضف 35 ميكرولترا من 5 وحدات لكل ميكرولتر من مخزون نوكلياز المكورات الدقيقة للحصول على تركيز نهائي يبلغ 25 10 وحدة ألفية لكل ميكرولتر. احتضن لمدة 12 دقيقة بالضبط عند 37 درجة مئوية.

امزج كل أربع دقائق. بعد 12 دقيقة ، ضع التفاعل على الفور على الجليد. لإيقاف نشاط نوكلياز المكورات الدقيقة ، أضف 56 ميكرولترا من 5 مولار EDTA درجة الحموضة 8.0 إلى التركيز النهائي البالغ 4 ملي مولار والدوامة.

احتضن لمدة خمس دقائق على الثلج. صوتية خمس مرات لمدة دقيقة واحدة في كل مرة بسعة عالية مما يسمح باستراحة لمدة دقيقة واحدة بين الصوتنة. قم بتغيير أجهزة الطرد المركزي لكل من الملح المستخرج والكسور المخصبة بالنيوكليوسوم لمدة 30 دقيقة عند 85،000 × جم عند أربع درجات مئوية.

اجمع المواد الطافية. يجب أن يكون الجزء القابل لاستخراج الملح حوالي 13 مل. ويجب أن يكون الجزء المخصب بالنوكليازوم حوالي 6 مل.

سيتم تنقية مجمعات بروتين MyoD عن طريق تنقية التقارب المزدوج. نظرا لأن إجراءات التنقية القائمة على FLAG والتنقية القائمة على HA متشابهة ، عرض التنقية القائمة على FLAG فقط. بعد إضافة TEGN ، انقل الحجم المناسب من راتنج FLAG إلى أنبوب سعة 50 مل.

هناك حاجة إلى 300 ميكرولتر من راتنج FLAG من راتنج FLAG للغسيل المسبق بنسبة 50٪ لكل نقطة تجريبية. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 1 ، 000 × جم. قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف TEGN البارد ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى.

اغسل راتنج FLAG ب TEGN البارد خمس مرات. بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق راتنج FLAG بحجم متساو من TEGN. لكل نقطة تجريبية ، امزج 300 ميكرولتر من راتنج FLAG المغسول ومستخلص البروتين المقابل.

استخدم أنبوبا سعة 15 مل للجزء المخصب بالنوكلياسوم وأنبوبا سعة 50 مل للجزء القابل لاستخراج الملح. احتضان الأنابيب على عجلة دوارة طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بأجهزة الطرد المركزي لجميع الأنابيب لمدة دقيقتين عند 1,000 × جم عند أربع درجات مئوية.

اجمع المواد الطافية واحتفظ بها عند أربع درجات مئوية حتى يتم الحصول على نتيجة اختبار كفاءة التنقية. بالنسبة للعينات القابلة لاستخراج الملح ، أعد تعليق راتنج FLAG في 4 مل من TEGN وانقله إلى أنبوب سعة 15 مل. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات ، في كل مرة انتقل إلى نفس 15 مل لتجنب فقدان الخرز.

جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 1,000 × جم عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة المادة الطافية ، أضف 13 مل من TEGN إلى راتنج FLAG وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 1,000 × جم عند أربع درجات مئوية. اغسل الراتنج سبع مرات بهذه الطريقة.

بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق الراتنج في 1 مل من TEGN وانقله إلى أنبوب ربط منخفض سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الراتنج لكل نقطة تجريبية في 100 ميكرولتر من محلول الببتيد FLAG عند 4 مجم / مل عند درجة الحموضة 7.8 تخلط جيدا وتضاف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TEGN.

احتضان عند أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل لتصفية البروتينات المقلدة. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين ونقل الراتنج والمادة الطافية إلى عمود دوران فارغ يوضع في أنبوب سعة 2 مل. الطرد المركزي العمود لمدة دقيقة واحدة عند 6 ، 000 × جم.

اجمع بقايا المادة الطافية في أنبوب 2 مل. ثم يتم اختبار كفاءة التنقية كما هو موضح في نص البروتوكول ، قبل متابعة التنقية القائمة على HA. تظهر هنا النتائج التمثيلية لمجمعات MyoD المنقاة ذات التقارب المزدوج من الملح النووي القابل للاستخراج أو الكسور المخصبة بالنوكلياسومات لخط خلية HeLa S3 التي تعبر بثبات عن FLAG HA MyoD.

تم تحديد تلطيخ الفضة FLAG HA MyoD المشار إليه بالسهم الغائب عن خط الخلية الوهمية. تم تجزئة مجمعات MyoD المنقاة ذات التقارب المزدوج على تدرجات الجلسرين. كشف النشاف الغربي للكسور باستخدام الأجسام المضادة ل FLAG عن المجمعات الفرعية ل MyoD في المقصورتين دون النوويتين.

على وجه الخصوص ، يتم توزيع MyoD القابل لاستخراج الملح في ثلاثة مجمعات فرعية بينما ينتمي MyoD المرتبط بالكروماتين بشكل أساسي إلى مجمع واحد. حدد تحليل قياس الطيف الكتلي لتفاعلات MyoD المعزولة من الملح النووي القابل لاستخراج الملح النووي والكسور المخصبة بالنيوكليوسوم سلسلة من الشركاء المعروفين والشركاء الجدد ل MyoD. هنا يتم تجميع تفاعلات MyoD الموجودة في كلا الكسرين أو ، على وجه التحديد لأحد الكسور ، بناء على التعليقات التوضيحية الوظيفية.

كشفت بعض التفاعلات التي تم تأكيدها بواسطة اللطخة الغربية على مجمعات MyoD. وتشمل هذه عوامل النسخ CBF ، والوحدة الفرعية SWI / SNF BAF47 و HP1 البروتينات. نظرا لأن خلايا HeLa ليست خلايا عضلية ولا تعبر عادة عن MyoD ، فمن الضروري تأكيد التفاعلات بين التفاعلات التي تم تحديدها حديثا و MyoD والأرومات العضلية.

تم استخدام المستخلصات النووية الكلية من الخلايا العضلية المتكاثرة والمتمايزة للفأر للترسيب المناعي والتحليل الغربي مع الأجسام المضادة المشار إليها. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في يومين ونصف إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحسين النتائج التي تم الحصول عليها في الأرومات العضلية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل ضربة قاضية للشريك المعين في نظام الملاءمة مثل الأرومات العضلية ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل المعنى الوظيفي للتفاعل. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم التخلق البيولوجي التنموي لاستكشاف شبكة التنظيم لخمسة عوامل نسخ في معظم أجهزة الجسم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد شركاء عامل النسخ عن طريق إجراء تجزئة الخلية متبوعا بتنقية التقارب الترادفي إلى جانب قياس الطيف الكتلي.