تحديد بروتين في مجمعات

الهدف من هذه التجربة هو تحديد البروتين، وتفاعلات البروتين، والتركيب الفرعي لمعقدات MultiPro الطبيعية من بكتيريا e coli. يتم تحقيق ذلك عن طريق تضخيم نواتج PCR الخطية المحددة للتسلسل، والتي تشفر وسم SPA وعلامة اختيار، حيث يتم دمجها والتعبير عنها في إطار كاندماجات طرفية كربوكسيلية في خلفية ddy 3, 3 0 باستخدام نظام إعادة التركيب بكتيريا Fage lambda؛ وكخطوة ثانية، يتم إجراء تنقية ثنائية الخطوة باستخدام cow modlin وخرزات ألفية Anti-Flag لاستعادة معقدات البروتين ذات الوفرة المنخفضة بكفاءة. بعد ذلك، يتم هضم البروتينات المرتبطة التي تم استخلاصها بواسطة cow modlin، أو منظم الاستخلاص، أو CEB باستخدام التريبسين، ومعالجتها عن طريق مطيافية الكتلة لتحديد هوية البروتين.

تظهر النتائج التي تم الحصول عليها أن العديد من الوحدات الفرعية لإنزيم RNA polymerase الأساسي، بما في ذلك عوامل إنهاء النسخ وعوامل مكافحة التحديد، قد تم تنقيتها بشكل مشترك وفعال مع بروتين الوحدة الفرعية D من إنزيم RNA polymerase المسمى، مما يشير إلى إمكانية الكشف عن المكونات المرتبطة حديثاً بكفاءة باستخدام هذا النهج. وبوجه عام، قد يواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة صعوبة في عمليات التنقية بتقارب الميول المكونة من جولتین، حيث يكون المعالجة الدقيقة لنواتج تحلل الخلايا باستخدام محاليل منظمة مناسبة ضرورية للغاية لضمان النجاح في الاستعادة الفعالة للمعقدات ذات الوفرة المنخفضة والعالية من المزارع واسعة النطاق. ستقوم Olga Kagan و HBO guo، وهما فنيتان في مختبري، باستعراض إجراءات التنقية بتقارب الميول ومطيافية الكتلة. يبدأ هذا البروتوكول باستهداف تتابعات مضخمة محددة في سلالة DDY three 30 التي يتم فيها التعبير عن آلية إعادة التركيب Lambda red كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

بعد ذلك، يتم استنبات سلالة نظام إعادة التركيب في بكتيريا farge Lambda التي تعبر عن البروتين طوال الليل في 2 mL من وسط Luria bati أو وسط LB عند درجة حرارة 32 °C، مع الرج بسرعة 180 RPM. وفي اليوم التالي، يتم تلقيح 1 mL من المزرعة الليلية في 70 mL من وسط LB طازج في دورق مخروطي سعة 500 mL. وتُنمى اللقاحات عند درجة حرارة 32 °C مع الرج بسرعة 180 RPM حتى تصل قيمة OD 600 إلى حوالي 0.8. ثم يتم تحفيز الخلايا عن طريق تحضين الدورق في حمام مائي عند درجة حرارة 42 °C مع الرج بلطف بسرعة 180 RPM لمدة 15 دقيقة.

مباشرة بعد الحث، يتم تحضين القارورة في حمام من مزيج الثلج والماء لمدة 30 دقيقة على الأقل مع الرج. بعد حصاد الخلايا وغسلها كما هو موضح في الإجراء المكتوب، يتم إعادة تعليق كتلة الخلايا في 700 µL من الماء المعقم البارد والمثلج، مما ينتج عنه خلايا كفؤة كهربائياً عن طريق التثقيب الكهربائي. أضف 1 µL من ناتج التضخيم المنقى إلى 40 µL من الخلايا الكفؤة كهربائياً.

يتم إجراء التثقيب الكهربائي للخلايا بعد عملية إعادة التركيب المتماثل والدمج. ويتم اختيار المحولات التي نجحت في إعادة تركيب الوسم/الكاسيت في الكروموسوم بناءً على مقاومتها للمضاد الحيوي can mycin. يتم اختيار عدة محولات لإجراء تحليل لطخة ويسترن للتحقق من التوليد الصحيح لبروتينات الاندماج المدمجة بـ SPA باستخدام الجسم المضاد Anti-Flag M2 الذي يتميز بانتقائيته تجاه حاتمات flag الخاصة بوسم SPA. يتم نقل 10 milliliters من المزرعة التي نمت طوال الليل إلى 990 milliliters من وسط tb الطازج المدعم بـ 25 micrograms per milliliter من can mycin في دورق سعة أربعة لترات.

قم بتنمية المزرعة عند 32 درجة مئوية مع الرج المستمر بسرعة 250 RPM لمدة تتراوح من خمس إلى ست ساعات حتى تصل قيمة OD 600 إلى ما بين اثنين وثلاثة. انقل مزرعة e coli SPA tag بحجم لتر واحد إلى زجاجات طرد مركزي نظيفة، وقم بتدوير الخلايا عند 4 درجة مئوية وبقوة 3,993 ×g لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بإعادة تعليق الخلايا كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

انقل العينات إلى كوب من الفولاذ المقاوم للصدأ ومعقم وموضع على الثلج لإجراء عملية السونيكة (المعالجة بالموجات فوق الصوتية). اغمر المسبار في العينة وقم بعملية السونيكة لمدة ثلاث دقائق. بعد السونيكة، اترك العينة لمدة دقيقتين إضافيتين لتبرد من فرط الإسخان الناتج عن العملية، وذلك قبل إجراء عملية الطرد المركزي للمحلل الناتج عن السونيكة.

انقل الطافي S بعناية من أنبوب الطرد المركزي إلى أنبوب فالكون من البولي بروبيلين سعة 50 milliliter. جمد العينة باستخدام النيتروجين السائل، ثم خزن مستخلص الخلايا المجمد الذي تمت معالجته بالموجات فوق الصوتية لمدة أقصاها ستة أشهر عند درجة حرارة minus 80 °C لاستخدامه مستقبلاً. لبدء عملية التنقية بالألفة لمستخلص الخلايا المجمد والمعالج بالموجات فوق الصوتية، ضع الأنبوب في ماء بارد، ثم حضن مستخلص خلايا TH مع 3 µL من benzo، وهو إنزيم نوكلياز، لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

إلى هذا الخليط، أضف المنظف غير الأيوني Triton X 100 و 200 µL من معلقات Anti-Flag M two agro beads. امزج المحتويات بلطف عن طريق تدوير الأنبوب لمدة ثلاث ساعات عند درجة حرارة 4 °C، وبعد مرور ثلاث ساعات من التدوير، قم بطرد مركزي للأنبوب عند 1,700 ×g لمدة ست دقائق. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل الطافي بعناية دون تعكير الراسب الرخو.

أعد تعليق الراسب في ما تبقى من محلول SNA ثم انقله إلى عمود تحضير من البولي بروبيلين. قم بإزالة سدادات المخرج السفلية للعمود للسماح للمادة المستخلصة بالنزول بفعل الجاذبية. بعد ذلك، اغسل العمود خمس مرات باستخدام 200 µL من محلول FC buffer بتركيز 1×، ثم انتقل إلى عملية الفصل باستخدام TEV كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

بعد عملية القطع، يتم التثبيت بإحكام على كل من الجزء العلوي والسفلي من العمود. امزج المحتويات الموجودة في العمود بلطف عن طريق التدوير طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. قم بتصريف السائل المستخلص عن طريق إزالة الغطاء العلوي والسدادة السفلية إلى عمود جديد.

اغسل العمود القديم بـ 400 µL من محلول Cal Modlin binding buffer بتركيز 1x و 150 µL من معلق Cal Modlin binding beads. استخلص البروتين المرتبط في أربعة أجزاء بحجم 50 µL لكل جزء في أنبوب eend orph نظيف، باستخدام محلول Cal Modlin elution buffer بتركيز 1x.

وزع الجزء المستخلص على أنبوبين نظيفين من نوع eend orph بأحجام متساوية. ثم جفف محتويات كلا الأنبوبين باستخدام جهاز الطرد المركزي المفرغ (speed vacuum). يُستخدم المستخلص المجفف من أحد الأنبوبين لتشغيل هلام صبغ الفضة كما هو موضح في النص، بينما يُخزن الآخر في درجة حرارة -80 °C.

للاستخدام المستقبلي في مطيافية الكتلة، أضف إلى العينة المجففة 50 µL من محلول التخضيم المنظم و0.9 µL من 100 mM tris phosphine hydrochloric acid، ثم قم بحضن الخليط لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإتمام خطوة الاختزال. بعد ذلك، أضف 1 µL من 500 mM IDO acetamide واحضن العينة في الظلام لمدة 40 دقيقة أخرى للسماح بحدوث عملية الألكلة. وبعد جولة الحضن الثانية، أضف 1 µg من trips إلى الخليط. احضن العينة إما عند 37 °C لمدة خمس ساعات أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة بعد عملية الحضن.

تأكد من إيقاف التفاعل عن طريق إضافة 1 µL من حمض الأسيتيك. بعد ذلك، قم بتجهيز طرف ماصة Millipore zip tip كما هو موضح في النص لضمان الارتباط الفعال للببتيد بطرف الماصة. اخلط خليط الببتيد 20 مرة، ثم اغسل خليط الببتيد الملتصق بطرف الماصة عن طريق سحب وتفريغ محلول الغسيل.

كرر هذا الإجراء مرتين لضمان الارتباط الفعال لخليط الببتيد بطرف الماصة، بحيث يحتوي الطرف على الببتيد المرتبط. اسحب 10 µL من محلول الترطيب والمعادلة ثم صبها في أنبوب إيبندورف (Eppendorf) نظيف. كرر هذه الخطوة مرتين.

بعد تجفيف العينات المستخلصة في جهاز التجفيف بالتفريغ السريع (speed vacuum)، يمكن تحليل العينات فوراً بواسطة مطياف الكتلة أو تخزينها عند درجة حرارة 80- درجة مئوية قبل الاستخدام. الأعمدة الدقيقة المستخدمة في هذا الإجراء محشوة بنحو 10 centimeters من راتنج lunar C 18 بحجم حبيبات 3 micron، وهي متصلة بمصدر تأين بالرش الكهربائي النانوي pro Zion nano electrospray يتم وضعه على خط واحد مع جهاز orbitrap. تُستخدم مضخة HPLC ثنائية التدفق pro Zion nano flow لتوفير معدل تدفق مستقر عند الطرف يبلغ حوالي 300 nanoliters في الدقيقة أثناء عمليات فصل الببتيدات، ولتحقيق تخفيف الببتيدات يتم إعداد تدرج للمحلول المنظم العضوي وفقاً لمدى تعقيد العينة.

بالنسبة لعينة الـ SPA من بكتيريا e coli هذه، يتكون مذيب الطور المتحرك A من 95% HPLC gradient water و 5% aceto nitrile مع 0.1% formic acid، بينما يتكون المذيب B من 5% HPLC gradient water و 95% aceto nitrile مع 0.1% formic acid. بعد تحليل طيف الكتلة، يتم البحث في الأطياف باستخدام خوارزمية بحث في قواعد البيانات مثل seaquest مقابل قاعدة بيانات لتسلسلات بروتينات e coli. يتم تصفية النتائج إحصائياً باستخدام خوارزمية احتمالية مثل star quest لضمان انخفاض معدل الاكتشاف الكاذب. وقد تم تنقية كل من RNA polymerase sigma factor و yak LA protein (بروتين غير معروف الوظيفة) الموسومين بـ SPA بشكل مشترك وتحديدي مع إنزيم RNA polymerase الأساسي، بما في ذلك الوحدات الفرعية alpha و beta و beta prime، بالإضافة إلى عامل إعادة تدوير RNA polymerase. وعلى عكس RNA polymerase sigma factor الموسوم، ارتبط yak L إضافياً بعامل مضاد للإنهاء ضروري لإنهاء عملية النسخ، مما يشير إلى وظيفة متخصصة في عملية النسخ.

كما تم الكشف بواسطة LCMS عن العديد من البروتينات الأخرى الأصغر التي تمت تنقيتها بشكل مشترك والتي لم تكن واضحة على الهلام، بما في ذلك الوحدة الفرعية Omega لإنزيم RNA polymerase وعوامل إنهاء وتحديد النسخ، وUSA وNUSD. وعلى العكس من ذلك، في تجربة مستقلة، تمت تنقية آليات تعبئة الكبريت الملحقة بـ tagged، وهي S-U-F-B-S-U-F-C وSUFD، بشكل مشترك مع بعضها البعض، مما يشير إلى مشاركتها الجماعية في التخليق الحيوي لعنقود الحديد والكبريت كمعقد سقالة واحد. ويسلط هذا المثال النموذجي الضوء على حقيقة أن معقدات MultiPro البكتيرية ذات التوصيف العالي والتي تمت دراستها جيداً سابقاً والمشاركة في عمليات بيولوجية أساسية غالباً ما تحتوي على مكونات مرتبطة جديدة يمكن تحديدها بكفاءة.

باستخدام هذا النهج، قد يكون العدد المنخفض لنسخ بروتين SUFB قد أدى إلى ضعف شدة الإشارة مقارنة بالشدة القوية الملاحظة في تجارب سحب SUFC وSUFD. ولتحديد تكوين معقدات بروتينية مستقرة متعددة الوحدات، تم تعيين درجات تنقية مشتركة للتفاعلات عالية الموثوقية من خلال مراعاة تفرد علاقات الطعم-الفريسة، والطعم-الطعم، والفريسة-الفريسة. ثم باستخدام إجراءات تجميع الرسوم البيانية مثل خوارزمية تجميع ماركوف، يتم تحديد تجمعات بروتينية منفصلة من شبكة تفاعلات البروتين-بروتين (PPI) الاحتمالية المقسمة.

يمكن تصور شبكات التفاعل المفترضة باستخدام cyto scape. ويمكن استخدام الجمع بين بيانات البروتيوميات وأدلة الارتباط الوظيفي الإضافية المستنتجة بواسطة طرق الجينوميات لاستقصاء أدوار ميكانيكية جديدة لبروتينات e coli التي تم توصيفها مسبقاً. وهنا، تم تحديد شبكات فرعية من المعقدات البروتينية والوحدات الوظيفية التي تشارك كأحياء وظيفية أوسع في e coli.

يُظهر مخطط التجميع الهرمي الرئيسي Graham أنماط التنبؤات الوظيفية والتوصيفات الموجودة للجينات اليتيمة وظيفياً والجينات الموصوفة في بكتيريا e coli، حيث يمثل اللونان الأصفر والأزرق الوظائف الموجودة والمستنتجة على التوالي، بينما تعكس كثافة الظلال درجات الثقة. وتُشار العمليات البيولوجية المرتبطة بمختلف المجموعات المجاورة على اليمين، وتوضح المربعات المدرجة المكونات الفردية لمجموعة مجاورة ممثلة بناءً على درجات تشابه شبكة التفاعلات الفيزيائية والوظيفية المتكاملة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل المعقدات البروتينية المستقرة من estia Coli باستخدام نهج التنقية بالتقارب المقترن بمطياف الكتلة.

من الناحية المبدئية، يمكن تطبيق هذه التقنية لتوصيف معقدات البروتين الغشائية أو معقدات البروتين من أي أنواع أخرى طالما كان إعادة تركيبها ممكناً.