تحديد بروتين في مجمعات كولاي استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

الهدف من هذه التجربة هو تحديد تفاعلات البروتين والبروتين وتكوين الوحدة الفرعية لمجمعات MultiPro الأصلية من e coli. يتم تحقيق ذلك عن طريق تضخيم منتجات PCR الخطية الخاصة بالتسلسل ، وترميز علامة SPA وعلامة قابلة للتحديد ، والتي يتم دمجها والتعبير عنها في إطار كاندماجات طرفية كربوكسي في خلفية ddy 3 ، 3 0 باستخدام نظام إعادة تركيب البكتيريا Fage lambda كخطوة ثانية يتم إجراء تنقية مزدوجة الخطوة باستخدام مودلين البقرة وخرز التقارب المضاد للعلم لاستعادة مجمعات البروتين منخفضة الوفرة بكفاءة. بعد ذلك ، يتم هضم البروتينات المرتبطة المشار إليها بمودلين البقر أو محلول الشطف أو CEB باستخدام التربسين ومعالجتها باستخدام قياس الطيف الكتلي لتحديد البروتين.

تظهر النتائج التي تم الحصول عليها أن الوحدات الفرعية العديدة لإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي الأساسي ، بما في ذلك إنهاء النسخ ، والعوامل المضادة للتحديد يتم تنقيتها بكفاءة مع بروتين الوحدة الفرعية لبوليميراز الحمض النووي الريبي الموسوم D ، مما يشير إلى أنه يمكن الكشف عن المكونات المرتبطة حديثا بكفاءة باستخدام هذا النهج. بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة من خلال تنقية التقارب الدائريتين ، حيث تكون المعالجة الدقيقة لمحللات الخلية باستخدام الحلول العازلة المناسبة ضرورية للغاية لضمان النجاح في الاسترداد الفعال لمجمعات عبء الوفرة المنخفضة والعالية من الثقافات واسعة النطاق ، مما يدل على إجراءات تنقية التقارب وقياس الطيف الكتلي ، وستكون أولغا كاجان و HBO guo فنيتان في مختبري. يبدأ هذا البروتوكول باستهداف تسلسلات تضخيم محددة لسلالة DDY three 30 حيث يتم التعبير عن آلية إعادة التركيب الأحمر Lambda كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

بعد ذلك ، حيث تعبر البكتيريا عن نظام إعادة التركيب Lambda عن الإجهاد بين عشية وضحاها في ملليلترين من Luria bati أو LB المتوسطة عند 32 درجة مئوية ، وتهتز عند 180 دورة في الدقيقة في اليوم التالي ، قم بتلقيح مليلتر واحد من المزرعة الليلية في 70 مل من وسط LB الطازج في قارورة مخروطية سعة 500 مل. قم بزراعة اللقاح عند 32 درجة مئوية عن طريق الرج عند 180 دورة في الدقيقة حتى يصل OD 600 إلى حوالي 0.8. قم بتحفيز الخلايا عن طريق احتضان القارورة في حمام مائي عند 42 درجة مئوية عن طريق رجها برفق عند 180 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.

مباشرة بعد الحث ، احتضان القارورة في حمام ملاط الماء المثلج لمدة 30 دقيقة على الأقل مع الرج. بعد حصاد الخلايا وغسلها كما هو موضح في الإجراء المكتوب ، يقوم ريس بتعليق حبيبات الخلية في 700 ميكرولتر من الثلج والماء البارد والمعقم مما ينتج عنه خلايا ذات كفاءة كهربائية من خلال التثقيب الكهربائي. أدخل ميكرولتر واحد من الأمبليكون المنقى في 40 ميكرولتر من الخلايا المختصة بالكهرباء.

يتم تكليف الخلايا بالكهرباء بعد إعادة التركيب المتماثل والتكامل. يتم اختيار المحولات التي أعادت بنجاح تجميع كاسيت العلامة المائلة في الكروموسوم بناء على مقاومة يمكن أن تختار المايسين محولات متعددة للنشاف الغربي للتحقق من الجيل الصحيح لبروتينات الاندماج الموسومة SPA مع جسم مضاد مضاد ل Flag M انتقائي ضد حواتم العلم لعلامة SPA نقل 10 ملليلتر من الثقافة الليلية إلى 990 مل من السل الطازج. مكمل ب 25 ميكروغرام لكل مليلتر من علبة المايسين في قارورة سعة أربعة لترات.

قم بزراعة المزرعة عند 32 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 250 دورة في الدقيقة لمدة خمس إلى ست ساعات حتى يصل OD 600 إلى ما بين درجتين إلى ثلاثة. انقل ثقافة علامة السبا التي سعة لتر واحد لتنظيف زجاجات الطرد المركزي وتدوير الخلايا عند أربع درجات مئوية و 3 ، 993 مرة جم لمدة 15 دقيقة. بعد إعادة التشكيل تعليق الخلايا كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

انقل العينات إلى كوب معقم من الفولاذ المقاوم للصدأ يوضع على الجليد للصوتنة. اغمر المسبار في العينة وصوتنة لمدة ثلاث دقائق. بعد الصوتنة ، اترك دقيقتين إضافيتين لتبريد العينة من ارتفاع درجة الحرارة بعد الطرد المركزي لمحالة الصوت.

انقل المادة الطافية S بعناية من أنبوب الطرد المركزي إلى أنبوب صقر بولي بروبيلين سعة 50 مل. قم بتجميد العينة باستخدام النيتروجين السائل وتخزين مستخلص الخلايا المجمدة الموبعة صوتنة لمدة أقصاها ستة أشهر عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للاستخدام في المستقبل. لبدء تنقية التقارب لمستخلص الخلايا المجمدة عن طريق وضع الأنبوب في الماء البارد ، احتضان مستخلص الخلية TH بثلاثة ميكرولتر من البنزو ، وهو نوكلياز لمدة 30 دقيقة من أربع درجات مئوية.

إلى هذا الخليط ، أضف المنظفات غير الأيونية Triton X 100 و 200 ميكرولتر المعلقات من الخرز الزراعي المضاد للعلم M. امزج المحتوى برفق عن طريق تدوير الأنبوب لمدة ثلاث ساعات عند أربع درجات مئوية بعد ثلاث ساعات من الدوران ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 1 ، 700 مرة G لمدة ست دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الطبقة بعناية دون إزعاج الحبيبات ذات السرعة السائبة.

أعد تعليق الحبيبات في SNA المتبقي ثم انقلها إلى عمود إعداد مادة البولي بروبلين. قم بإزالة سدادات المخرج السفلية للعمود للسماح للتصريف بالجاذبية. تدفق. بعد ذلك ، اغسل العمود خمس مرات ب 200 ميكرولتر من مخزن مؤقت FC مرة واحدة وانتقل إلى Cleve باستخدام TEV كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

بعد الانقسام السريع في كل من الجزء العلوي والسفلي من العمود بإحكام. امزج المحتويات في العمود برفق عن طريق الدوران طوال الليل عند أربع درجات مئوية بعد الدوران طوال الليل. قم بتصريف المصفاة عن طريق إزالة الغطاء العلوي والقابس السفلي في العمود الجديد.

اغسل العمود القديم ب 400 ميكرولتر من مخزن مؤقت ربط Modlin واحد × cal وتعليق 150 ميكرولتر من حبات ربط Cal Modlin. قم بتخفيض البروتين المرتبط في أربعة أجزاء من 50 ميكرولتر في أنبوب أورف جديد. باستخدام مخزن مؤقت شطف Modlin واحد × cal.

قم بتوزيع الكسر المغطى إلى أنبوبين نظيفين من الألواح الخشبية بأحجام متساوية. ثم جفف محتويات كلا الأنبوبين باستخدام فراغ السرعة. يستخدم التحفيط المجفف من أحد الأنابيب لتشغيل جل تلطيخ الفضة كما هو موضح في النص بينما يتم تخزين الآخر في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر.

للاستخدام المستقبلي في قياس الطيف الكتلي للعينة المجففة ، أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للهضم و 0.9 ميكرولتر من 100 مللي مولار حمض الهيدروكلوريك ثلاثي الفوسفين يحتضن الخليط لمدة 45 دقيقة من درجة حرارة الغرفة لخطوة التخفيض بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من أسيتاميد IDO 500 مللي مولار واحتضنه في الظلام لمدة 40 دقيقة أخرى. للسماح بأخذ عينة من الألكلة بعد الجولة الثانية من الحضانة ، أضف ميكروغراما واحدا من الرحلات إلى الخليط. احتضان العينة إما عند 37 درجة مئوية لمدة خمس ساعات أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة.

تأكد من إيقاف التفاعل بإضافة ميكرولتر واحد من حمض الأسيتيك. ثم قم بإعداد طرف Millipore المضغوط ، طرف الماصة كما هو موضح في النص للربط الفعال للببتيد بأنبوب الطرف. اخلطي خليط الببتيد 20 مرة واغسل خليط الببتيد الذي فعله في الحافة عن طريق شفط محلول الغسيل وتوزيعه.

كرر هذا الإجراء مرتين للربط الفعال لخليط الببتيد بالحافة مع الطرف الذي يحتوي على الببتيد المرتبط. استنشق 10 ميكرولتر من محلول الترطيب والتوازن الإلكتروني وقم بتوزيعه في أنبوب نظيف من الكرة الأرضية. كرر هذه الخطوة مرتين.

بعد تجفيف العينات المملحة في فراغ سريع ، يمكن تحليل العينات على الفور عن طريق قياس الطيف الكتلي أو تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر قبل الاستخدام. الأعمدة الدقيقة المستخدمة في هذا الإجراء معبأة بحوالي 10 سنتيمترات من راتنج C 18 قمري بثلاثة ميكرون ويتم توصيلها بمصدر أيون الرش الكهربائي النانوي للاحتياء الذي يتم وضعه بما يتماشى مع أداة orbitrap. يتم استخدام مضخة HPLC ثنائية ذات تدفق نانوي للصهيون لتوفير معدل تدفق طرف ثابت يبلغ حوالي 300 نانولتر في الدقيقة أثناء عمليات فصل الببتيد لتحقيق تخفيف الببتيد ، وإعداد تدرج عازل عضوي وفقا لتعقيد العينة.

بالنسبة لعينة e coli SPA هذه ، يحتوي مذيب الطور المتحرك A على 95٪ ماء متدرج HPLC و 5٪ أسيتو نتريل مع 0.1٪ حمض فورميك بينما يحتوي المذيب B على 5٪ ماء متدرج HPLC و 95٪ أسيتو نتريل مع 0.1٪ حمض فورميك بعد قياس الطيف الكتلي يبحث في الأطياف باستخدام خوارزمية بحث قاعدة بيانات مثل Seaquest مقابل قاعدة بيانات لتسلسلات بروتين الإشريكية القولونية. قم بتصفية النتيجة إحصائيا باستخدام خوارزمية احتمالية مثل البحث عن النجوم لضمان معدل اكتشاف خاطئ منخفض ، كل من عامل سيجما بوليميراز الحمض النووي الريبي الموسوم ب SPA وبروتين ياك LA ذو الوظيفة غير المعروفة المنقى بشكل خاص مع إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي الأساسي بما في ذلك الوحدات الفرعية ألفا بيتا وبيتا الأولية ، بالإضافة إلى عامل إعادة تدوير بوليميراز الحمض النووي الريبي. على النقيض من عامل سيجما للحمض النووي الريبي المميز ، يرتبط المثل L بالإضافة إلى عامل التحديد المضاد لإنهاء النسخ الأساسي ، مما يشير إلى وظيفة متخصصة في النسخ.

تم اكتشاف العديد من بروتينات التنقية المشتركة الأصغر الأخرى بواسطة LCMS التي لم تكن واضحة على الجل ، بما في ذلك الوحدة الفرعية لبوليميراز الحمض النووي الريبي أوميغا وعوامل النسخ والإنهاء والتحديد والولايات المتحدة الأمريكية و NUSD. على العكس من ذلك ، في تجربة مستقلة تم وضع علامة على تعبئة آلات الكبريت ، تم تنقية S-U-F-B-S-U-F-C و SUFD مع بعضهما البعض ، مما يشير إلى المشاركة المشتركة في التخليق الحيوي لكتلة كبريت الحديد كمركب سقالات واحد. يسلط هذا المثال التمثيلي الضوء على حقيقة أن مجمعات MultiPro البكتيرية المشروحة للغاية التي تمت دراستها جيدا سابقا والمشاركة في العمليات البيولوجية الأساسية غالبا ما تحتوي على مكونات جديدة مرتبطة يمكن تحديدها بكفاءة.

باستخدام هذا النهج ، قد يكون العدد المنخفض من بروتين SUFB قد أدى إلى شدة إشارة ضعيفة بالنسبة للكثافة القوية التي لوحظت من تجارب سحب SUFC و SUFD لتحديد تكوين مجمعات البروتين المستقرة متعددة الوحدات ، تم تعيين درجات التنقية المشتركة لتفاعلات الثقة العالية من خلال مراعاة تفرد فريسة الطعم ، طعم الطعم وعلاقات الفريسة الفريسة. ثم استخدام إجراءات تجميع الرسم البياني مثل خوارزمية تجميع markoff. يتم تحديد مجموعات البروتين المنفصلة من شبكة PPI الاحتمالية المقسمة.

يمكن تصور شبكات التفاعل المفترضة باستخدام cyto scape. يمكن استخدام الجمع بين بيانات البروتينات وأدلة الارتباط الوظيفي الإضافية المستنبطة من خلال طرق الجينوم للتحقيق في الأدوار الميكانيكية الجديدة لبروتينات الإشريكية القولونية المشروحة مسبقا. هنا ، تم تحديد الشبكات الفرعية لمجمعات البروتين والوحدات الوظيفية التي تشارك كأحياء وظيفية أوسع في الإشريكية القولونية.

المجموعة الهرمية الرئيسية غراهام أنماط التنبؤات الوظيفية والتعليقات التوضيحية الحالية للجينات اليتيمة والمميزة وظيفيا للألوان القولونية والصفراء والزرقاء تمثل الوظائف الحالية والمستنبطة على التوالي بينما تعكس شدة الظل درجات الثقة. يشار إلى العمليات البيولوجية المرتبطة بالأحياء المختلفة على الأجزاء الداخلية اليمنى تظهر المكونات الفردية للحي التمثيلي بناء على درجات تشابه شبكة التفاعل المادي والوظيفي المتكاملة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل مجمعات البروتين المستقرة من estia Coli باستخدام تنقية التقارب إلى جانب نهج قياس الطيف الكتلي.

من حيث المبدأ ، يمكن تطبيق هذه التقنية لتوصيف مجمعات البروتين الغشائي أو مجمعات البروتين من أي نوع آخر لإعادة تجميعها قدر الإمكان.