تطوير في المختبر الفحص لتقييم مقلص وظيفة الخلايا الجذعية الوسيطة التي خضعت طلائي-الوسيطة الانتقالية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم انقباض الخلايا الوسيطة التي خضعت في المختبر للانتقال الوسيط الظهاري الناجم عن السيتوكين الالتهابي ، أو EMT. هذا اللحمة المتوسطة هو اختلاف في وظيفة الخلية الأساسية بعد EMT الناجم عن الاستجابات المناعية الالتهابية مثل أثناء التليف الرئوي مجهول السبب أو إعادة تشكيل مجرى الهواء في الربو الحاد. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها لا تتطلب أجهزة محددة وأنها توضح محتوى عاليا Demontating سيكون الإجراء طلاب الدراسات العليا Hideyuki Takeshima و Kosuke Makita من مختبري.

ابدأ بغسل مزرعة الخلايا الظهارية للرئة البشرية A-549 بخمسة إلى عشرة مليليات من PBS. بعد ذلك ، افصل الخلايا الملتصقة بمليليتين من التربسين EDTA عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. بعد ثلاث دقائق ، انقل معلق الخلية إلى أنابيب مخروطية تحتوي على وسط زراعة الخلايا وقم بتدوير الخلايا في جهاز طرد مركزي.

أعد تعليق الكريات في مليليتين من وسط زراعة الخلايا ، مع الاحتفاظ ببلاغة صغيرة للعد. ثم قم بزرع 0.5 إلى 1 في 10 إلى الخلايا السادسة في عشرة مليليات من طبق البوليسترين المتوسط لكل عشرة سنتيمترات واحتضان المزارع الخلوية لمدة 24 ساعة. لتحريض EMT ، في اليوم التالي ، عالج الخلايا ب 10 ميكرولترات من TGF beta 1 و TNF alpha ، وأعد الألواح إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة أخرى.

في اليوم الرابع ، اغسل الثقافات التي يسببها EMT بخمسة إلى عشرة مليليترات من pbs ، ثم افصل الخلايا باستخدام التربسين-EDTA كما هو موضح للتو. بعد ذلك ، قم بتدوير معلقات الخلايا في DMEM المكملة بمثبط التربسين وأعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من الرصاص. ثم عد الخلايا ، وأضف وسط جيل محضر طازجا إلى كثافة 3 أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر ، مع خلط المحلول برفق ولكن بسرعة بواسطة الماصة قبل الهلام.

على الفور ، ولكن بعناية ، قم بتوزيع 0.5 ملليلتر من الخلايا في كل بئر من صفيحة 24 بئر غير معالجة في أشكال أسطوانية أنيقة. ثم ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 15 دقيقة. عندما يتجمد الجل تماما ، حرك ملعقة معقمة في دائرة حول الجزء الخارجي من كل هلام في اتجاه واحد ، لفصل المواد الهلامية عن الألواح دون أن تنكسر.

عند إزالة الجل ، احرص على عدم تحريك الملعقة ذهابا وإيابا في البئر. ثم استخدم الملعقة لنقل المواد الهلامية برفق إلى أطباق زراعة الأنسجة الفردية مقاس 16 ملم التي تحتوي على خمسة مليليترات من DMEM مكملة بواحد بالمائة FBS ، مع أو بدون TGF beta 1 و TNF alpha. أخيرا ، رج الأطباق برفق للتأكد من أن المواد الهلامية تطفو على الوسط ، وأعد المواد الهلامية إلى حاضنة زراعة الخلايا.

تظهر خلايا a541 غير المعالجة مظهرا يشبه الحصى ومثلث الشكل ، وهو سمة من سمات الخلايا الظهارية. بعد تحفيزها باستخدام TGF beta 1 و TNF alpha ، تظهر الخلايا شكل مغزل طويل ، مشابه لذلك الذي لوحظ للخلايا المسلسلة. يكشف QRTCPR للتعبير عن العلامة الظهارية والمتزامنة قبل وبعد EMT أن خلايا A541 المعالجة بالسيتوكينات الالتهابية لمدة 48 ساعة تظهر انخفاضا كبيرا في التعبير عن CDH1 وزيادة كبيرة في تعبيرات VIAM و ACTA2.

علاوة على ذلك ، فإن التحفيز باستخدام هذه السيتوكينات يخفف من تعبير E-cadherin على النحو الذي يحدده تحليل الدم الغربي ، في حين يتم تحفيز تعبيرات vimentin N-cadherin و alpha smooth Actin . في مقايسة تقلص الهلام ، بعد 48 ساعة ، تكون المواد الهلامية التي تحتوي على الخلايا المعالجة ب TGF beta 1 و TNF alpha أصغر من المواد الهلامية الخاضعة للرقابة التي تحتوي على خلايا معالجة ب PBS. في الواقع ، بعد 72 ساعة ، يتم تقليل حجم المواد الهلامية التي تحتوي على المواد الهلامية المعالجة بالسيتوكين بشكل كبير ، مقارنة بالمواد الهلامية الخاضعة للرقابة كما تم قياسها بواسطة محلل الجل.

كما لوحظ ، يمكن إكمال خطوات تقلص الهلام في غضون ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التأكد من أن EMT قد تم تحريضه بنجاح قبل إجراء فحص تعاقد الهلام. بعد الملاحظة ، توفر هذه التقنية طريقة لتغيير عملية EMT أثناء الحالة الالتهابية مثل التليف أو إعادة تشكيل الرئة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إصدار الخلايا التي تحتوي على EMT ، إلى نوع من cuagenter ورغوتها في المتوسط.