نموذج قائم على خلية المشيمية الضفيرة طلائي من الجدار السائل الإنسان الدم النخاعي لدراسة العدوى البكتيرية من الجانب Basolateral

الهدف العام من هذه الطريقة هو إنشاء نموذج قائم على الخلية الظهارية الضفيرة المشيمية لحاجز السائل الدموي النخاعي البشري. تمكين دراسة الالتهابات البكتيرية من الجانب القاعدي الجانبي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الأمراض المعدية للجهاز العصبي المركزي ، مثل العمليات التي تشارك أثناء التفاعلات البكتيرية مع ظهارة الضفيرة المشيمية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحليل تفاعلات مسببات الأمراض مع الجانب الأسود الجانبي القاعدي للخلايا الظهارية. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على دراسات أخرى مثل التحقيق في انتقال الخلايا المناعية والخلايا السرطانية عبر ظهارة الضفيرة المشيمية. خطرت لي لأول مرة فكرة استخدام الورم الحليمي الضفيرة الحيرية البشرية ، أو خلايا HIBCCP لهذه الطريقة عندما قرأت مخطوطة عام 2005 التي كتبها Shibata et.al.

وصف خط الخلية. ابدأ باستخدام ملقط معقم لوضع 0.33 سم مربع منطقة نمو إدراج مرشح ثقافة الخلية ، مع ثلاثة مسام بحجم ميكرون رأسا على عقب في آبار فردية من اثني عشر لوحة بئر. بعد ذلك ، باستخدام ماصة مصلية ، قم بإغراق البئر بحوالي ثلاثة ملليلتر من الوسط الدافئ مسبقا ، مع شفط أي محلول إضافي ، حتى تمتلئ الحجرة السفلية.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرومتر من وسط الزراعة الفرعية 37 درجة مكملا بعشرة بالمائة FCS أعلى المرشح. عند إضافة الوسيط ، من المهم جدا تجنب توليد فقاعات الهواء ، لأن الفقاعات ستمنع الخلايا من التغذية بشكل كاف. عندما تتم إضافة الوسيط إلى جميع الإدخالات ، قم بتغطية اللوحة وانقل الإدخالات إلى 37 درجة مئوية خمسة بالمائة حاضنة ثاني أكسيد الكربون.

الآن ، اغسل قارورة من خلايا HIBCPP بعشرة ملليلتر من PVS ، مرتين مع الدوامة. بعد الغسيل الثاني ، أضف ثلاثة ملليلتر من 0.25 بالمائة تريبسين EDTA إلى الخلايا وقم بتدوير القارورة. ثم احتضان الخلايا لمدة عشرين دقيقة.

في نهاية الحضانة ، تأكد من أن الخلايا قد رفعت من أسفل القارورة واعرض شكلا دائريا. لا تنفصل الخلايا تماما عن بعضها البعض وغالبا ما توجد في التكتلات. أعد تعليق الثقافة ب 17 مل من الوسط لإيقاف التفاعل ونقل التعليق إلى أنبوب سعة 50 مل.

ثم, قم بتدوير الخلايا, وأعد تعليق الحبيبات في حجم مناسب من الوسط للعد. بعد ذلك ، قم بتخفيف الخلايا إلى واحد في عشرة إلى الخلايا السادسة لكل تركيز مليلتر ، وقم بقلب الأنبوب لتوزيع الخلايا بالتساوي. ثم أضف 80 لترا صغيرا من الخلايا إلى الجزء العلوي من كل ملحق مرشح.

عندما يتم زرع جميع الإدخالات ، قم بتغطية اللوحة ، وأعدها إلى الحاضنة للاستزراع بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، أضف ملليلتر واحد من المتوسط إلى كل بئر من طبق 24 بئر. بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، ارفع كل ملحق وتخلص من الوسط بالداخل ، ووضع الإدخالات على الجانب الأيمن لأعلى في آبار فردية من لوحة 24 بئر.

عندما يتم قلب إدخالات المرشح من لوحة 12 بئر إلى لوحة 24 بئر ، احرص على عدم لمس غشاء المرشح مع نمو الخلايا في الأعلى. املأ الإدخالات ب 0.5 مل من الوسط الطازج ، وأعد اللوحة إلى الحاضنة. انقل الإدخالات إلى صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا بوسط جديد كل يومين ، وبالتالي استبدال الوسط الموجود في المقصورة العلوية.

لقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة ، أو TEER للخلايا ، قم أولا بغمر أطراف القطب الكهربائي لمقياس فولت أوم للأنسجة الظهارية في 80 بالمائة من الإيثانول. بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة القطب من الإيثانول للسماح للقطب بالجفاف. بعد ذلك ، ضع النصائح في جزء من وسط الزراعة الفرعية لمدة 15 دقيقة أخرى.

عندما يكون القطب متوازنا ، ضع الذراع الأطول بحيث يلامس الجزء السفلي من بئر واحد من لوحة زراعة الخلية ، والذراع الأقصر بحيث يصل إلى حجرة إدخال المرشح. قم بقياس قيم المقاومة لإدخالات مرشح ثقافة الخلية في وسط بدون خلايا للحصول على القيم الفارغة. ثم قم بقياس TEER لكل من الإدخالات المصنفة.

بعد القياس ، ضع القطب مرة أخرى في 80 في المائة من الإيثانول لمدة 15 دقيقة ، متبوعا بالتخزين في أنبوب جاف. عندما تتجاوز قيم TEER لإدخالات HIBCPP المصنفة 70 أوم لكل سنتيمتر مربع ، قم بتجديد الوسط باستخدام وسط استزراع طازج مكمل بخمسة ميكروغرامات لكل مليلتر من الأنسولين وواحد بالمائة FCS ، وأعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا طوال الليل. لتحديد النفاذية شبه الخلوية لمزارع الإدخال ، أضف 50 ميكروغراما لكل مليلتر من FITC-inulin المحضر حديثا في وسط مزرعة مصل طازج منخفض إلى حجرة المرشح العلوية لكل إدراج ، وأعد الخلايا إلى الحاضنة.

عندما تصل الثقافات إلى TEER يبلغ حوالي 500 أوم لكل سنتيمتر مربع ، قم بإصابة الخلايا بتعليق بكتيري ذي أهمية عند تعدد العدوى من عشرة ، وإعادة الخلايا إلى الحاضنة لفترة الزراعة المناسبة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا ثلاث مرات عن طريق نقل الفلتر إلى بئر جديد باستخدام مليلتر واحد من الوسط الخالي من المصل. في كل مرة ، ضع الوسيط في حجرة المرشح مع 500 لتر ميكرو من نفس الوسط ، وأخيرا ، حدد تركيز الأنسولين الذي يمر من حجرة المرشح عبر طبقة الخلية بعد العدوى البكتيرية عن طريق جمع عينات متوسطة من البئر السفلي لكل إدراج مرشح ثقافة الخلية ، وقياس جميع العينات في قارئ لوحة صغيرة مقابل عشرة تخفيفات قياسية واحد واثنين من FITC-inulin.

تظهر خلايا HIBCCP وظائف حاجز محددة تمكنها من تقييد تبادلاتها الجزيئية بدرجة متواضعة. على سبيل المثال ، تكشف التحليلات المناعية الفلورية لنوع الوصلة المرتبطة بالبروتين ، ZO-1 و Occludin و Claudin-1 ، عن إشارة غير منقطعة في مواقع الاتصال بين الخلية والخلية. توضيح الترابط بين الخلايا من خلال خيوط مستمرة من التقاطعات الضيقة.

عند استزراعها في ظل الظروف المناسبة ، تظهر خلايا HIBCPP إمكانات غشائية عالية ، تصل إلى حوالي 500 أوم لكل سنتيمتر مربع دون علاج ، مما يحافظ على وظائف الحاجز النموذجي لحاجز السائل الدموي النخاعي ، مثل تكوين إمكانات الغشاء ، فضلا عن نفاذية منخفضة للجزيئات الكبيرة. ومع ذلك ، مع تطبيق تركيزات متزايدة من DMSO ، تنخفض قيم TEER بطريقة تعتمد على الجرعة ، مع انخفاض كبير مماثل في قيمة TEER لوحظ بعد العلاج بالسيتوكالاسين D. أكثر من ذلك ، تؤدي إضافة اثنين بالمائة من DMSO ، أو Cytochalasin D ، إلى زيادة نفاذية كبيرة مقابلة لتدفق FITC-inulin.

علاوة على ذلك ، تؤدي العدوى البكتيرية لخلايا HIBCCP إلى غزو كبير لطبقة الخلية بواسطة سلالتين بكتيريتين مسببة للأمراض. MC58 ، ومتحولها الذي يعاني من نقص الكبسولة. في حين لوحظ غزو طفيف فقط لسلالة ألفا 14 الممرضة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم لمس غشاء المرشح بعد بذر الخلايا حيث ستتعطل طبقة HIBCCP السليمة بسبب جهة الاتصال. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات التحويل في المختبر للإجابة على أسئلة إضافية حول آليات هجرة الخلايا المناعية والسرطانية عبر الخلايا الظهارية للضفيرة المشيمية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأدوية لاستكشاف نقل الركائز عبر ظهارة الضفيرة المشيمية في المختبر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد نموذج قائم على خلايا HIBCCP لحاجز السائل الدموي النخاعي للعدوى الجانبية القاعدية بمسببات الأمراض. لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأن الاحتياطات مثل العمل تحت غطاء أمان مناسب يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.