الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

الهدف العام لهذه الطريقة التجريبية هو تمكين الدراسة في الوقت الفعلي للإشارات داخل الخلايا باستخدام تصوير FRET للخلايا المضمنة في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد التي تحاكي الأنسجة الطبيعية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء التنموي وعلم الأدوية والطب التجديدي ، مثل تطوير المواد الحيوية المثلى وفحص الأدوية عالي الإنتاجية في الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد المهندسة الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدام FRET على عدد كبير من الخلايا في العديد من أنواع الهيدروجيل باستخدام أنظمة المجهر التقليدية واسعة المجال.

بعد تصنيع قوالب لصب الهيدروجيل وتعليق الخلايا المستزرعة في محلول هيدروجيل ، وفقا لبروتوكول النص ، في غطاء زراعة الأنسجة ، أضف الخلية التي تحتوي على سلائف إلى قوالب الصب باستخدام تقنية معقمة. قبل التشابك ، قم بتدوير الخلايا المعلقة في سلائف هيدروجيل لتحسين التصوير عن طريق حصر الخلايا في مستوى بؤري واحد ، وتقليل إشارة خارج المستوى. بعد ذلك ، لربط الهلاميات المائية للكمبيوتر الشخصي ، استخدم مصدر ضوء UVA لفترة تعرض يساوي 3.2 جول لكل سنتيمتر مربع لكل ملليمتر من السماكة لإشعاع الخلية التي تحتوي على سلائف.

بالتناوب ، استخدم مصباح أسنان أقل تكلفة. تجنب الإفراط في تعريض الهيدروجيل ، لأن هذا سيقلل من صلاحية الخلية. بدلا من ذلك ، يتم وضع الهلاميات المائية المتشابكة جسديا عند 37 درجة مئوية.

بعد التشابك ، قم بإزالة قالب صب الهيدروجيل PDMS ، واستبدله بطبق PDMS المعد مسبقا. استخدم ملعقة معقمة للضغط على PDMS لأسفل على الزجاج للالتصاق به. أضف وسيطا خاليا من المصل الخالي من الفينول أو وسيطا محددا كيميائيا إلى البئر الذي تم إنشاؤه في طبق PDMS مع غطاء للحفاظ على الهيدروجيل مغمورا.

احتضن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بمجرد تأمين طبق PDMS مع الهيدروجيل على مرحلة المجهر وتطبيق الزيت على الهدف ، استخدم الضوء المنقول للعثور على 15 خلية على الأقل للتصوير ، والتحقق من التعداء باستخدام التصوير الفلوري. في برنامج المجهر ، قم بتكوين إعدادات الكاميرا لقنوات صور FRET عن طريق الاختيار من بين عدد قليل من الخلايا بالقرب من مركز مجال الرؤية ، وتحسين التعرض والكسب لكل قناة صورة وفقا لبروتوكول النص.

اختر الخلايا القريبة من مركز الهيدروجيل ، داخل مجال الإضاءة المسطح نسبيا الذي ليس ساطعا جدا ولا خافتة جدا ، وبنسبة FRET بين 00 و 1.0. بعد ذلك، حدد حقول رؤية متعددة للحصول على صور لما لا يقل عن 15 خلية منقولة. أطفئ الضوء عند الانتهاء للحد من التعرض.

لتكوين معدل الالتقاط للحصول على صورة بفاصل زمني، أدخل دورية اللقطات. استخدم معدلا سريعا لالتقاط إشارة خط الأساس، مثل كل خمس ثوان لكل مجال رؤية، ومعدل أبطأ لحركية الإشارات اللاحقة طويلة المدى. حدد تشغيل الآن لبدء الحصول على الصور والتقاط الصور لمدة خمس دقائق لإنشاء خط أساس لاستجابة المسبار في مجال العرض المحدد.

بعد خمس دقائق من الحصول على الصورة ، قم بوضع الماصة في ناهض أو مضاد مطلوب ، واخلطها عن طريق سحب العينات ، واستمر في التصوير. بعد إجراء معايرة FRET وفقا لبروتوكول النص ، في برنامج المجهر ، حدد السهم الموجود على أيقونة منطقة الخلفية محل الاهتمام واختر رسم منطقة الخلفية الإهليلجية ذات الاهتمام. ارسم وقم بتعيين منطقة اهتمام واحدة ، أو عائد الاستثمار ، لكل مجال رؤية بالقرب من الخلايا لتحديد مستوى الخلفية.

تأكد من تحديد Keep Update Background Offset (الاحتفاظ بتحديث Background Offset)، ثم قم بتنشيط عرض منطقة الخلفية ذات الاهتمام بالنقر فوق أيقونة Background Region of Interest. بدلا من ذلك، اختر أيقونة منطقة الاهتمام، وقم بتعيين خصائص منطقة الاهتمام على أنها استخدام كمنطقة اهتمام في الخلفية، وتختلف مناطق الاهتمام في كل نقطة متعددة. باستخدام أيقونة خلفية منطقة الاهتمام، حدد طرح الخلفية باستخدام منطقة الاهتمام.

في النافذة المنبثقة، ضمن طرح منطقة الاهتمام في الخلفية، حدد كل صورة وضمن تطبيق على، حدد كافة الإطارات. لكل مجال رؤية، لتحديد منطقة اهتمام حول الخلية باستخدام قناة إرسال المستقبل والقناع الثنائي، استخدم القائمة Binary، Define Threshold، وحدد Apply To Current Frame. ثم اضبط الحد الأدنى لتحديد الخلايا.

بعد ذلك ، استخدم وظيفة الإغلاق الثنائي لملء الثغرات في القناع الثنائي ، إذا لزم الأمر. بعد ذلك، استخدم أيقونة منطقة الاهتمام لتحديد نسخ ثنائي إلى منطقة الاهتمام لحفظ القناع الثنائي كمناطق اهتمام. قم بإلحاق مناطق الاهتمام لحقول العرض اللاحقة بالمجموعة الحالية لمناطق الاهتمام.

احذف أي مناطق زائفة ذات أهمية. بعد ذلك ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق مناطق الاهتمام وتحقق من استخدام خصائصها كمنطقة اهتمام قياسية ومناطق الاهتمام مختلفة في كل نقطة متعددة. يمكن رسم منطقة اهتمام الخلية يدويا ، ولكن يجب توخي الحذر لإزالة القيم الزائفة.

يحتوي البروتوكول على إجراءات للخلايا الموجودة خارج مجال الإضاءة المسطحة والمجاهر التي ليس لها مجال مسطح. أدى الطرد المركزي لسلائف الهيدروجيل قبل الهلام إلى زيادة عدد الخلايا في مستوى بؤري واحد بالقرب من الغطاء. أدى هذا إلى تقليل ضوضاء الخلفية وزيادة إنتاجية التصوير.

في تجربة FRET هذه ، من أجل حساب نسبة الانبعاث المروي ، أو QE ، FRET ، كانت هناك حاجة إلى صورتين فقط لمسبار ICUE1 الثنائي أحادي السلسلة ، بما في ذلك التيسير الكمي يساوي CFP CFP للإثارة والانبعاث ، وانبعاث المستقبل يساوي YFP YFP للإثارة والانبعاث. تم اختيار مجالات رؤية متعددة توجد فيها عدة خلايا داخل منطقة الإضاءة المتجانسة كما هو موضح هنا. تم تعيين عائد الاستثمار لتصحيح خلفية إشارات القناة وتحليل الخلايا باستخدام صور انبعاث متقبل العتبة من بداية التجارب.

بالإضافة إلى ذلك ، كما هو موضح هنا ، تم اختيار الخلايا التي عبرت عن مسبار كاف. تم حساب نسب التيسير الكمي والانبعاثات الحساسة FRET لكل بكسل ومتوسط نسبة FRET لكل خلية. تم حساب معكوس نسبة SE وتم تطبيع كلتا النسبتين.

تحت تحفيز فورسكولين, كل من التيسير الكمي والجنوب الأوروبي نسب فريت على أساس الكشف عن زيادة نشاط أمبير الدوري في الخلايا الغضروفية. أظهر كل من المواد الهلامية المتشابكة الماديا والمتشابكة كيميائيا زيادة في نسبة FRET التيسير الكمي بمرور الوقت, مما يشير إلى زيادة استجابة إشارات AMP الدورية لإضافة فورسكولين. يمكن استخدام هذا الإجراء مع تقنيات الفحص المجهري الأخرى مثل FRAP ، والحنق الفليم ، وقياس الحنق وتباين الخواص ، للإجابة على أسئلة مثل ، ما هي الاختلافات في النفاذية والتفرد الخلوي بين أنواع الأنسجة الدقيقة المختلفة.

نظرا لأن التشابك يتم إخماده بالقرب من PDMS ، فمن المهم أن تتذكر تصميم قوالب الهلاميات المائية المتشابكة للصور التي يبلغ قطرها أكبر قليلا من الهلاميات المائية نفسها.