الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

الهدف العام من هذه الطريقة التجريبية هو تمكين الدراسة الآنية للإشارات داخل الخلايا باستخدام تصوير FRET للخلايا المدمجة ضمن هيدروجيلات ثلاثية الأبعاد تحاكي الأنسجة الطبيعية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات علم الأحياء النمائي، وعلم الصيدلة، والطب التجديدي، مثل تطوير المواد الحيوية المثلى والفحص عالي الإنتاجية للعقاقير في الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد المهندسة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية استخدام FRET على عدد كبير من الخلايا في أنواع متعددة من الهيدروجيل باستخدام أنظمة مجهر المجال الواسع التقليدية.

بعد تصنيع قوالب صب الهيدروجيل وتعليق الخلايا المستزرعة في محلول الهيدروجيل، وفقاً للبروتوكول النصي، وفي غطاء استزراع الأنسجة، أضف السلف المحتوي على الخلايا إلى قوالب الصب باستخدام تقنية معقمة. وقبل عملية الربط التشابكي، قم بطرد الخلايا المعلقة في سلف الهيدروجيل مركزياً لتحسين التصوير من خلال حصر الخلايا في مستوى بؤري واحد، وتقليل الإشارة خارج المستوى. بعد ذلك، لربط هيدروجيل PC تشابكياً، استخدم مصدر ضوء UVA لفترة تعريض تعادل 3.2 joules/cm² لكل mm من السمك لإشعاع السلف المحتوي على الخلايا.

وبدلاً من ذلك، استخدم مصباح أسنان محمولاً أقل تكلفة. تجنب تعريض الهيدروجيل لجرعة زائدة من الضوء، لأن ذلك سيقلل من حيوية الخلايا. أما الهيدروجيلات ذات الربط التشابكي الفيزيائي، فتوضع بدلاً من ذلك عند 37 درجة مئوية.

بعد عملية الربط التشابكي، قم بإزالة قالب صب هيدروجيل PDMS، واستبدله بطبق PDMS الذي تم تحضيره مسبقاً. استخدم ملعقة معقمة للضغط على PDMS فوق الزجاج لضمان التصاقه. أضف وسطاً خالياً من الفينول والمصل أو وسطاً محدداً كيميائياً إلى الفجوة الموجودة في طبق PDMS مع استخدام شريحة غطاء لإبقاء الهيدروجيل مغموراً.

تُحضن الطبق عند درجة حرارة 37 °C لمدة 30 دقيقة. وبمجرد تثبيت طبق PDMS الذي يحتوي على الهيدروجيل على منصة المجهر ووضع الزيت على العدسة الشيئية، استخدم الضوء النافذ للعثور على 15 خلية على الأقل للتصوير، وتحقق من عملية عفن الخلية (transfection) باستخدام التصوير الفلوري. وفي برنامج المجهر، قم بتكوين إعدادات الكاميرا لقنوات صور FRET من خلال اختيار عدد قليل من الخلايا القريبة من مركز مجال الرؤية، وقم بتحسين التعرض (exposure) والكسب (gain) لكل قناة صور وفقاً للبروتوكول النصي.

اختر الخلايا القريبة من مركز الهيدروجيل، ضمن مجال إضاءة مستوٍ نسبياً بحيث لا تكون ساطعة جداً ولا خافتة جداً، وبنسبة FRET تتراوح بين 0.0 و1.0. بعد ذلك، حدد عدة مجالات رؤية لالتقاط صور لما لا يقل عن 15 خلية محولة جينياً. أطفئ الضوء عند الانتهاء للحد من التعرض.

لتكوين معدل الالتقاط الخاص بالحصول على صور الفاصل الزمني، أدخل دورية عمليات الالتقاط. استخدم معدلاً سريعاً لالتقاط إشارة الخط القاعدي، مثل كل خمس ثوانٍ لكل مجال رؤية، ومعدلاً أبطأ لحركية الإشارات طويلة المدى اللاحقة. حدد "Run now" لبدء عملية الحصول على الصور والتقاط صور لمدة خمس دقائق لإنشاء خط قاعدي لاستجابة المسبار في مجال الرؤية المحدد.

بعد مرور خمس دقائق من اكتساب الصور، قم بإضافة المناهض (agonist) أو المضاد (antagonist) المطلوب باستخدام الماصة، ثم اخلط المزيج عن طريق السحب والضخ بالماصة، وواصل التصوير. بعد إجراء معايرة FRET وفقاً للبروتوكول المكتوب، اختر السهم الموجود على أيقونة منطقة الاهتمام الخاصة بالخلفية في برنامج المجهر، ثم اختر "رسم منطقة اهتمام بيضاوية للخلفية" (Draw Elliptical Background Region of Interest). ارسم وحدد منطقة اهتمام واحدة، أو ROI، لكل مجال رؤية بالقرب من الخلايا لتحديد مستوى الخلفية.

تأكد من تحديد خيار Keep Updating Background Offset، ثم قم بتفعيل عرض منطقة الاهتمام بالخلفية من خلال النقر على أيقونة Background Region of Interest. بدلاً من ذلك، اختر أيقونة منطقة الاهتمام، واضبط خصائص منطقة الاهتمام على Use as Background Region of Interest، و Regions of interest are different in each Multi Point. وباستخدام أيقونة خلفية منطقة الاهتمام، اختر Subtract Background Using Region of Interest.

في النافذة المنبثقة، وتحت خيار Subtract Background Region of Interest، اختر Every Image، وتحت خيار Apply To، اختر All Frames. ولتحديد منطقة اهتمام حول الخلية لكل مجال رؤية باستخدام قناة انبعاث المستقبل وقناع ثنائي، استخدم القائمة Binary، ثم Define Threshold، واختر Apply To Current Frame. بعد ذلك، قم بتعديل الحد الأدنى (lower threshold) لتحديد الخلايا.

بعد ذلك، استخدم وظيفة الإغلاق الثنائي (Binary Close) لملء الفجوات في القناع الثنائي، إذا لزم الأمر. ثم، استخدم أيقونة منطقة الاهتمام (Region of Interest) لاختيار "نسخ الثنائي إلى منطقة الاهتمام" (Copy Binary to Region of Interest) لحفظ القناع الثنائي كمناطق اهتمام. قم بإلحاق مناطق الاهتمام الخاصة بمجالات الرؤية اللاحقة بمجموعة مناطق الاهتمام الموجودة.

احذف أي مناطق اهتمام زائفة. بعد ذلك، انقر بزر الماوس الأيمن فوق مناطق الاهتمام وتحقق من أن خصائصها هي "Use as Standard Region of Interest" وأن "Regions of Interest are different in each Multi Point". يمكن رسم مناطق اهتمام الخلايا يدويًا، ولكن يجب توخي الحذر لإزالة القيم الزائفة.

يحتوي البروتوكول على إجراءات للخلايا التي تقع خارج مجال الإضاءة المسطح وللمجاهر التي لا تملك مجالاً مسطحاً. وقد أدى الطرد المركزي لسلائف الهيدروجيل قبل عملية الهلام إلى زيادة عدد الخلايا في مستوى بؤري واحد بالقرب من غطاء الشريحة إلى أقصى حد، مما قلل من ضوضاء الخلفية وزاد من إنتاجية التصوير.

في تجربة FRET هذه، ولحساب نسبة FRET للانبعاث المخمد، أو QE، تطلب الأمر صورتين فقط للمسبار الثنائي ICUE1 أحادي السلسلة، بما في ذلك QE التي تساوي CFP CFP للإثارة والانبعاث، وانبعاث المستقبل الذي يساوي YFP YFP للإثارة والانبعاث. تم اختيار عدة مجالات رؤية تتواجد فيها عدة خلايا ضمن منطقة الإضاءة المتجانسة كما هو موضح هنا. تم تحديد مناطق الاهتمام (ROIs) لتصحيح خلفية إشارات القنوات ولتحليل الخلايا باستخدام صور انبعاث المستقبل ذات العتبة المحددة من بداية التجارب.

بالإضافة إلى ذلك، وكما هو موضح هنا، تم اختيار الخلايا التي عبرت عن مسبار كافٍ. وتم حساب نسب FRET للانبعاث المحسس (SE) وكفاءة الكم (QE) لكل بكسل، بالإضافة إلى متوسط نسبة FRET لكل خلية. كما تم حساب مقلوب نسبة SE ومعايرة كلتا النسبتين.

تحت تأثير تحفيز الفورسكولين، تكتشف نسب Fret القائمة على كل من QE وSE زيادة نشاط cyclic AMP في الخلايا الغضروفية. أظهرت كل من الهلامات ذات الروابط المتشابكة فيزيائياً والروابط المتشابكة كيميائياً زيادة في نسبة QE FRET بمرور الوقت، مما يشير إلى زيادة استجابة إشارات cyclic AMP عند إضافة الفورسكولين. يمكن استخدام هذا الإجراء مع تقنيات مجهرية أخرى مثل FRAP وflim fret وقياسات fret والتباين (anisotropy)، للإجابة على أسئلة مثل: ما هي الاختلافات في النفاذية والإشارات الخلوية بين أنواع الأنسجة الدقيقة المختلفة.

بما أن عملية التشابك يتم تثبيطها بالقرب من الـ PDMS، فمن المهم تذكر تصميم قوالب الهيدروجيل ذات التشابك الضوئي بقطر أكبر قليلاً من قطر الهيدروجيل نفسه.