Name: كشف اللحاء شظايا خلال البكتيرية سبور الإنبات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: اكتشف طريقة كشف السكريات المختزلة وأجزاء القشرة أثناء إنبات الأبواغ البكتيرية باستخدام Clostridium difficile. تُساعد هذه التقنية الباحثين على فهم ديناميكيات إنبات الأبواغ وعمليات التمثيل الغذائي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويدعم المشروع التي وصفها جائزة عدد 5R01AI116895 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية أو المعاهد الوطنية للصحة.

1. عينات توليد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة تفعيل C. صعب الجراثيم عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتخزينها على الجليد. ملاحظة: C. جراثيم صعب يمكن أن تنتج وتنقيته كما هو موضح سابقا 7،9،10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل الإنبات في X + 1 مل حيث X هو عدد العينات التي تؤخذ أثناء الفحص. ملاحظة: الحل إنبات محددة لأنواع من البكتيريا الجراثيم التي تجري دراستها. لمعايرة C. صعب بوغ الإنبات، استخدمنا حل 10 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 100 الجلايسين ملي و 10 ملي حمض taurocholic في الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في الفحص، رسم 1.0 مل عينة من الحل إنبات الجراثيم دون أن تكون فارغة للكشف عن القشرة شظية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الجراثيم إلى OD 600 من ~ 3.0 إلى حل الإنبات ودوامة بسرعة. ملاحظة: للحصول على الدراسات الإنبات لدينا في B. الرقيقة، استخدمنا نفس OD 600 الجراثيم بالنسبة للC. صعب. ملاحظة: هذا المبلغ من الجراثيم عملت بشكل جيد للرصد القشرة الافراج عن جزء خلال C. صعب بوغ الإنبات. وينبغي أن تحدد كمية من الجراثيم المستخدمة في هذا الاختبار تجريبيا لكل بكتيريا أو السلالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 1.2 مل عينة فورا بعد إضافة الجراثيم وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة في 14000 × ز. وهذه هي النقطة الساعة الصفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1.0 مل من طاف من العينة طرد لأنبوب جديد لتحليل قشرة جزء لاحق. ملاحظة: يجب DPA تحتاج إلى رصد، إزالة عينة 100 ميكرولتر منفصلة للكشف عن DPA في الحل باستخدام مقايسة على أساس التيربيوم مضان 9،18،19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد العينة التي تم جمعها في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1.4 و 1.5 على فترات منتظمة حتى الانتهاء من جميع نقاط الوقت. ملاحظة: بسبب الوقت اللازم لالطرد المركزي وأخذ العينات، ونقاط وقت أقل عشركان ل2 دقيقة بعيدا يكن من الممكن أثناء إجراء دينا، لذلك كانت فترات أخذ العينات لدينا مرة واحدة كل دقيقة 2 لمدة 14 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما تحكم إيجابية للحد من الكشف عن السكر وتقدير، وتشمل المبالغ التالية N -acetylglucosamine (نانومول): 0، 12.5، 25، 50، 100، 250، 500، و 5،000. إعداد هذه العينات في نفس الوقت الذي عينات القشرة وتشغيل جنبا إلى جنب مع عينات القشرة بحيث منحنى هو معيار ذات الصلة البيانات التي تم إنشاؤها من قبل الإنبات جراثيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن يتم جمع كل العينات نقطة زمنية، يجفد العينات. ملاحظة: نحن مجفف بالتجميد عينات لدينا في 2 مل أنابيب المسمار الحد الأقصى. </li></ol> 2. قياس اللحاء شظايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend العينات مجفف بالتجميد في 120 ميكرولتر من 3 N حمض الهيدروكلوريك تستكمل مع الفينول 1٪ و 0.5٪ β-المركابتويثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات معلق إلى 2 مل أنابيب المسمار الحد الأقصى. ملاحظة: للحصول على التكاثر، وضمان معلق كل عينة مجفف بالتجميد ونقل. </li> &lt;لى&gt; احتضان هذه العينات في حمام مائي إعادة تدوير في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، ووضع العينات على الجليد حتى أنها باردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحييد العينات مع 120 ميكرولتر من 3 M هيدروكسيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 80 ميكرولتر من محلول بيكربونات الصوديوم المشبعة و 80 ميكرولتر من 5٪ محلول أنهيدريد الخل لكل عينة ودوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات إلى 95 ° C حمام الماء لمدة 3 دقائق بالضبط. ملاحظة: هذه الخطوة وقتا طويلا الأوقات الحساسة وأطول يمكن أن يؤثر على نمو إشارة المصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عينات من الحمام المائي وتبرد على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 400 ميكرولتر من 6.54٪ K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O لكل أنبوب والدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذه العينات في حمام مائي إعادة تدوير في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق بالضبط. ملاحظة: هذه الخطوة وقتا طويلا الأوقات الحساسة وأطول يمكن أن يؤثر على نمو إشارة المصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالةالعينات ومكان على الجليد لمدة 5 دقائق. </li></ol> 3. اللون الكاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما العينات على الجليد (الخطوة 2.12)، وإعداد كاشف اللون. حل 0.320 غرام من ص -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB، كاشف إرليخ) في 1.9 مل من حمض الخليك الجليدي. ملاحظة: الكاشف الوقت ودرجة الحرارة والضوء حساسة ويجب أن لا يتم مقدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد DMAB يذوب تماما، إضافة 100 ميكرولتر من 10 N حمض الهيدروكلوريك ودوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من حمض الخليك الجليدي ودوامة. </li></ol> 4. رد الفعل اللونية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 100 ميكرولتر من كل عينة تبرد القشرة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 700 ميكرولتر من محلول اللون الطازجة إلى كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور نقل العينات إلى 37 درجة مئوية الماء حمام واحتضان لمدة 20 دقيقة بالضبط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 200 ميكرولتر من كل عينة إلى لوحة 96-جيدا واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد العينات عند 585 نانومتر على طبق من ذهبقارئ. وينبغي أن تبدأ عينات في اللون الأصفر، وسوف رد فعل إيجابي يتحول إلى اللون الأرجواني. المزيد من القشرة الوقت الحاضر، وعمق اللون الأرجواني. </li></ol>

<ol><li>Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clostridium+sporulation+programs%3A+diversity+and+preservation+of+endospore+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).</li>
<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+spores+of+Bacillus+species%3A+what+we+know+and+do+not+know%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).</li>
<li>Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+formation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Spore formation in Bacillus subtilis.</a> Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).</li>
<li>Fimlaid, K. A., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+mechanisms+regulate+sporulation+sigma+factor+activity+in+the+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes.</a> Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).</li>
<li>Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+peptidoglycan+structure+of+Bacillus+subtilis+endospores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores.</a> J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).</li>
<li>Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+168+endospore+peptidoglycan+and+its+role+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation.</a> J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).</li>
<li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salts+and+glycine+as+cogerminants+for+Clostridium+difficile+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores.</a> J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+spore+biology%3A+sporulation%2C+germination%2C+and+spore+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins.</a> Trends Microbiol. 22 (7), (2014).</li>
<li>Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+cortex+hydrolysis+precedes+DPA+release+during+Clostridium+difficile+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination.</a> J Bacteriol. 197 (14), (2015).</li>
<li>Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acid+recognition+by+the+Clostridium+difficile+Germinant+Receptor%2C+CspC%2C+is+important+for+establishing+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection.</a> PLoS Pathog. 9, e1003356(2013).</li>
<li>Moir, A., Smith, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+bacterial+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Genetics of bacterial spore germination.</a> Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).</li>
<li>Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Raman+tweezers+and+quantitative+differential+interference+contrast+microscopy+for+measurement+of+dynamics+and+heterogeneity+during+the+germination+of+individual+bacterial+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores.</a> Journal of biomedical optics. 15, 056010(2010).</li>
<li>Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+that+degrade+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymes that degrade bacterial cell walls.</a> Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).</li>
<li>Park, J. T., Johnson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+submicrodetermination+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A submicrodetermination of glucose.</a> J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).</li>
<li>Thompson, J. S., Shockman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+the+Park+and+Johnson+reducing+sugar+determination+suitable+for+the+assay+of+insoluble+materials%3A+its+application+to+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls.</a> Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SleC+is+essential+for+cortex+peptidoglycan+hydrolysis+during+germination+of+spores+of+the+pathogenic+bacterium+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens.</a> J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+cortex-lytic+enzyme+SleC+from+non-food-borne+Clostridium+perfringens+on+the+germination+properties+of+SleC-lacking+spores+of+a+food+poisoning+isolate%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate.</a> Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).</li>
<li>Hindle, A. A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipicolinic+acid+%28DPA%29+assay+revisited+and+appraised+for+spore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection.</a> The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).</li>
<li>Kort, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+heat+resistance+of+bacterial+spores+from+food+product+isolates+by+fluorescence+monitoring+of+dipicolinic+acid+release%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).</li>
<li>Elson, L. A., Morgan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+method+for+the+determination+of+glucosamine+and+chondrosamine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine.</a> The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).</li>
<li>Ramirez, N., Abel-Santos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+germination+of+Clostridium+sordellii+spores+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro.</a> J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).</li>
<li>Akoachere, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentification+of+an+in+vivo+inhibitor+of+Bacillus+anthracis+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination.</a> J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).</li>
<li>Duncan, C. L., Strong, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+medium+for+sporulation+of+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens.</a> Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).</li>
<li>Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+four+cortex+lytic+enzymes+to+germination+of+Bacillus+anthracis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores.</a> J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).</li>
<li>Meador-Parton, J., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+spore+peptidoglycan+during+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation.</a> J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).</li>
<li>Lambert, E. A., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacillus+anthracis+SleL+%28YaaH%29+protein+is+an+N-acetylglucosaminidase+involved+in+spore+cortex+depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization.</a> J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).</li>
<li>Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Dynamic+Germination+of+Individual+Clostridium+difficile+Spores+Using+Raman+Spectroscopy+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

على التحفيز، الجراثيم التي تمر بعملية الإنبات تفقد خصائص مقاومة من دون الحاجة إلى تركيب الجزيئات. عندما يتم تشغيل إنبات الجراثيم، جوهر بوغ النشرات DPA مقابل الماء 2. نظرا لما يحتويه DPA عالية من الجراثيم نائمة، جوهر بوغ تحت الضغط الاسموزي الشديد وببتيدوغليكان المتخصصة، والقشرة، يساعد على منع الأساسية من تورم من خلال العمل، ويفترض، كحاجز للتوسع 2. الطريقة المذكورة أعلاه يستخدم كاشف إرليخ (حل ...

الأبواغ هي عملية الأيض أشكال نائمة من البكتيريا التي تسمح للبكتيريا ان تستمر في البيئات غير المواتية. في كثير من البكتيريا المكونة للبوغ، هو فعل تشكيل بوغ بالحرمان من المغذيات ولكن يمكن التحكم في هذه العملية من خلال التغييرات في درجة الحموضة، والتعرض للأكسجين أو ضغوط أخرى 1. بينما في شكل بوغ نائمة عملية الأيض، والبكتيريا تقاوم الأشعة فوق البنفسجية، جفاف، ارتفاع درجات الحرارة، وتجميد 2. معظم المعارف على عملية تكاثر يأتي من دراسات في الكائن الحي نموذج، العصوية الرقيقة. تبدأ عملية تبوغ مع تكرار الحمض النووي وتشكيل 3،4 خيوط المحوري. والحاجز غير المتماثلة ثم يقسم الخلية إلى قسمين الحجم غير متكافئ. مقصورة أكبر، الخلية الأم، يجتاح حجرة صغيرة، وforespore. كل من الخلية الأم وforespore تنسيق التعبير الجيني لانضاج الجراثيم والخلية الأم انحلال في نهاية المطاف، والإفراج عن دورمانر بوغ في البيئة المحيطة 1. يتم حفظها هيكل الجراثيم والتكوين عبر العديد من الأنواع البكتيرية. جوهر بوغ يحتوي على نسبة الماء أقل من الخلية النباتية وغنية بحمض dipicolinic (د ب أ) 1،2. خلال تشكيل بوغ، يتم ضخ DPA في صلب بوغ في مقابل الماء. المحيطة الأساسية هو غشاء بوغ الداخلي حيث، في معظم البكتيريا بوغ تشكيل، والمستقبلات التي تعترف الجزيئات الصغيرة التي تحفز إنبات (germinants) تقع 2. يقع خارج الغشاء الداخلي للبوغ هو طبقة من ببتيدوغليكان جدار الخلية. وهناك طبقة ببتيدوغليكان المتخصصة (القشرة) تحيط ببتيدوغليكان جدار الخلية وتتكون من العديد من نفس المكونات كما ببتيدوغليكان جدار الخلية [بالتناوب N-اسيتيل (ناغ) وحمض N-acetylmuramic (NAM)]. ومع ذلك، فقد تم تحويل ما يقرب من 50٪ من بقايا حركة عدم الانحياز في القشرة لالموراميك-δ لاكتام 5،6 </sتصل&gt;. خلال إنبات الجراثيم، يتم التعرف على هذه المخلفات الموراميك-δ لاكتام من قبل بوغ قشرة الانزيمات التحللي (SCLEs)، مما يسمح للقشرة إلى أن يتحلل (وهي عملية ضرورية لإتمام الإنبات) ولكن ليس جدار الخلية. المحيطة القشرة هو الغشاء الخارجي وعدة طبقات من البروتينات معطف 2. السيطرة على عملية الإنبات أمرا شديد الأهمية للبكتيريا تشكيل بوغ. يبدأ الإنبات عندما تتفاعل مستقبلات germinant مع germinants كل فيما يخصه 2. في كثير من البكتيريا المكونة للبوغ، هذه germinants هي الأحماض الأمينية والسكريات، النيوكليوتيدات، أيونات أو خليط منها 2. C. يبدأ صعب بوغ إنبات عن طريق مزيج من بعض أنواع الحوامض الصفراء، [على سبيل المثال، حمض taurocholic (TA)] والأحماض الأمينية (على سبيل المثال، الجلايسين) 7-10. على الرغم من وجود اختلافات بين C. العسيرة مسار الإنبات ومسارات درس في البعض تشكيل بوغالبكتيريا، مثل B. الرقيقة، مشتركة بين جميع هو شرط مطلق للحط من القشرة بوغ للسماح للخلية النباتية لتنمو من بذرة نبتت 2،8. تدهور القشرة يمكن أن يتحقق من قبل SCLEs CwlJ / SleB (كما هو موجود في B. الرقيقة) أو SleC (كما هو موجود في كثير من المطثيات). قشرة المائي يقلل من القيود على جدار الخلية والجراثيم. وهذا يسمح لمعالجة الجفاف الأساسية كاملة، خطوة ضرورية في تنشيط العديد من البروتينات اللازمة لعمليات أيض الخلايا 2. عندما تنبت الجراثيم، والتغيرات بوغ نائمة من دولة مرحلة مشرقة لدولة مرحلة مظلمة وهذه العملية يمكن قياس التغير في الكثافة الضوئية (OD) في 600 نانومتر 11. ويشير التقرير السابق أن جزءا كبيرا من هذا التغيير في التطوير التنظيمي ويرجع ذلك إلى الإفراج عن DPA من بوغ 12. خلال دراستنا الأخيرة، سعينا لمقارنة توقيت C. صعب بوغ الإنبات ومراقبةالافراج عن الشؤون السياسية والقشرة شظايا 9. لهذه الدراسة انه من الضروري مراقبة الإفراج عن شظايا القشرة لأنها بدأت سيصدر من قبل الإنبات جراثيم. واستند الفحص اللونية المستخدمة هنا على طريقة للكشف عن السكريات مع الحد من الغايات وضعت Ghuysen وآخرون. 13. لأن الآخرين قد وصف بروتوكولات للكشف عن السكريات المختزلة 14 أو عدلت هذه البروتوكولات 15، والأدب حول هذا الموضوع يمكن أن يكون مربكا. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة خطوة بخطوة للكشف اللونية من السكريات المختزلة تتحرر من الإنبات C. جراثيم صعب. على الرغم من يستخدم هذه الدراسة C. جراثيم صعب، والسكريات المختزلة صدر خلال إنبات الجراثيم من البكتيريا الأخرى لتشكيل بوغ هي قادرة على أن الكشف عن هذا البروتوكول 9،16،17.

<table><tbody><tr><td>2.0 مل أنبوب غطاء لولبي</td><td>الولايات المتحدة الأمريكية العلمية</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 ماصة Eppendorf</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Eppendorf ماصة Eppendorf p20</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ماصة Eppendorf P20 Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1،250 &# 956 ؛ ل نصائح الماصة</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &# 956 ؛ ll نصائح الماصة</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-D-glucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>حمض الهيدروكلوريك - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>أنهيدريد الخليك</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>بيكربونات الصوديوم</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr> رباعي <tr><td>هيدرات البوتاسيوم</td><td>Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>هيدروكسيد الصوديوم</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4- (ثنائي ميثيل أمينو) بنزالديهايد</td><td>سيجما</td><td>156477-100 جم</td><td></td></tr><tr><td>الفينول المشبع</td><td>فيشر</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td> الأجهزة <td></td><td></td><td>الجزيئية</td></tr><tr><td>حمض الخليك ، الجليدي</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>ساخنة ، حمام مائي</td> متداول <td>VWR نموذج علمي</td><td>1136</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 96</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>96 لوحة ثقافة الأنسجة الواضحة</td></tr> جيدا <tr><td>أنابيب الثقافة</td><td>VWR</td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> آلة <tr><td>دوامة</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>كتل الحرارة</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

كشف اللحاء شظايا خلال البكتيرية سبور الإنبات

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

تم العثور على عملية إنبات الأبواغ الداخلية في المطثية العسيرة وغيرها من المطثيات ، بشكل متزايد لتختلف عن البكتيريا المكونة للأبواغ النموذجية ، Bacillus subtilis. يتم تشغيل الإنبات بواسطة نبتات جزيئات صغيرة ويحدث دون الحاجة إلى التخليق الجزيئي الكبير. على الرغم من وجود اختلافات بين آليات إنبات الأبواغ في أنواع Bacillus و Clostridium ، إلا أن الشرط الشائع هو التحلل المائي للقشرة الشبيهة بالببتيدوغليكان والذي يسمح للب البوغ بالانتفاخ وإعادة الترطيب. بعد الجفاف ، يمكن أن يبدأ التمثيل الغذائي وهذا يؤدي في النهاية إلى نمو خلية نباتية. قد يكون اكتشاف شظايا القشرة المتحللة أثناء إنبات الأبواغ أمرا صعبا ويمكن أن تكون التعديلات على المقايسات الموصوفة سابقا مربكة أو يصعب إعادة إنتاجها. وبالتالي ، بناء على تقريرنا الأخير باستخدام هذا الاختبار ، نقوم بتفصيل بروتوكول خطوة بخطوة للكشف اللوني عن شظايا القشرة أثناء إنبات الأبواغ البكتيرية.

ويبين الجدول 1 نتائج نموذجية باستخدام معايير ناج. وتستخدم البيانات لإنشاء منحنى القياسية. ويبين الجدول 2 النتائج نموذجية من فحص الإنبات في المخزن إنبات تستكمل مع 100 الجلايسين ملي و 10 ملي TA (الظروف المعززة للإنبات) أو 100 الجلايسين ملم فقط (شروط عدم الإنبات). في غياب TA، C. جراثيم صعب لا تنبت، وهناك تغيير طفيف في وجود شظايا القشرة في الحل. ومع ذلك، في حضور كل من TA والجلايسين، C. جراثيم...

هنا ، نصف مقايسة لونية للكشف عن وجود السكريات المختزلة أثناء إنبات الأبواغ البكتيرية.

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

الهدف العام من هذا البروتوكول المفصل هو قياس كمية شظايا القشرة أو السكريات المختزلة أثناء إنبات الأبواغ البكتيرية. ستفصل هذه الطريقة الخطوات المطلوبة للكشف عن وجود شظايا القشرة أو السكريات المختزلة خلال عملية إنبات الأبواغ. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن معظم المختبرات تمتلك الكواشف والمعدات اللازمة لإتمام البروتوكول بنجاح.ابدأ هذا الإجراء بوضع أنبوب يحتوي على أبواغ Clostridium difficile في كتلة تسخين وتحضينه عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد التحضين، ضع الأنبوب على الثلج. يكون محلول الإنبات خاصاً بنوع الأبواغ البكتيرية قيد الدراسة.لمعايرة إنبات أبواغ *C.difficile*، نستخدم محلولاً مكوناً من 10 millimolar من Tris عند pH 7.5 مع 150 millimolar من كلوريد الصوديوم، و100 millimolar من الجلايسين، و10 millimolar من حمض التوروكوليك في ماء منزوع الأيونات. قم بتحضير واحد milliliter من محلول الإنبات لكل عينة بالإضافة إلى واحد milliliter إضافي. وقبل البدء في المعايرة، انقل واحد milliliter من محلول الإنبات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق واتركه جانباً.سيعمل هذا كعينة فارغة (blank) للكشف عن شظايا القشرة. بعد ذلك، أضف الأبواغ إلى محلول الإنبات للوصول إلى قيمة OD600 تبلغ حوالي 3.0، ثم قم برجها لفترة وجيزة باستخدام جهاز الفورتيكس. هذه الكمية من الأبواغ تعمل بشكل جيد على ضبط عملية تحرر شظايا القشرة أثناء إنبات أبواغ C.difficile.مباشرة بعد إضافة الأبواغ، انقل عينة بحجم 1.2 milliliter إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وضعها في جهاز الطرد المركزي. ثم قم بإجراء الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة عند 14,000 ×g. تمثل هذه الخطوة نقطة الزمن صفر. بعد عملية الطرد المركزي، انقل 1 milliliter من الطافي إلى أنبوب جديد بسعة 2 milliliter ذو غطاء لولبي وجمده عند -80 °C.كرر عملية أخذ العينات الفرعية، والطرد المركزي، والتجميد على فترات منتظمة حتى يتم جمع العينة لكل نقطة زمنية. ونظراً للوقت المطلوب للطرد المركزي وأخذ العينات، فإن النقاط الزمنية التي تقل عن دقيقتين غير ممكنة خلال هذا الإجراء، لذا يتم أخذ هذه العينات مرة كل دقيقتين لمدة 14 دقيقة. وأثناء تحضير عينات القشرة المخية، إذا لزم مراقبة حمض dipicolinic، فقم بإزالة عينة منفصلة بحجم 100 µL ووضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق على الثلج.قم أيضاً بتجهيز عينات لإنشاء منحنى قياسي بكميات من N-acetylglucosamine كما يلي: صفر، و 12.5، و 25، و 50، و 100، و 250، و 500، و 5,000 nanomoles في محلول الإنبات. بعد جمع عينة لكل نقطة زمنية، أخرج العينات من المجمد وقم بتجفيدها مع العينة الفارغة وعينات المنحنى القياسي.بعد ذلك، تُحفظ جميع العينات عند درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى وقت الاستخدام. وفي يوم إجراء المقايسة، يتم إعادة تعليق العينات المجففة بالتجميد، بما في ذلك عينات الضبط وعينات منحنى القياس، في 120 µL من حمض الهيدروكلوريك مع الفينول وبيتا-مركابتويثانول. ثم تُنقل جميع العينات المعاد تعليقها إلى أنابيب جديدة ذات غطاء لولبي سعة 2 mL.ثم يتم تحضينها في حمام مائي دوار عند 95 °C لمدة أربع ساعات. وبعد التحضين، توضع العينات على الثلج حتى تبرد. ثم يُضاف 120 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 3 M لمعادلتها.بعد ذلك، أضف 80 µL من محلول بيكربونات الصوديوم المشبع و 80 µL من محلول أنهيدريد الأسيتيك بتركيز 5% إلى كل عينة مع الرج بجهاز vortex. ثم قم بحضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. وعقب عملية الحضن، انقل العينات مرة أخرى إلى حمام مائي بدرجة حرارة 95 °C لمدة ثلاث دقائق بالضبط.لاحظ أن هذه الخطوة حساسة للوقت، وقد تؤثر الفترات الأطول على تطور الإشارة في المراحل اللاحقة. أخرج العينات من الحمام المائي وقم بتبريدها على الثلج. أضف 400 µL من potassium tetraborate tetrahydrate بتركيز 6.54% إلى كل أنبوب واستخدم جهاز الـ vortex.قم بتحضين العينات في حمام مائي مُدوّر عند 95 درجة مئوية لمدة سبع دقائق بالضبط. هذه الخطوة حساسة للوقت أيضاً. أخرج العينات وضعها على الثلج لمدة خمس دقائق.بينما توضع العينات على الثلج، قم بتحضير كاشف اللون. أذب 0.320 grams من DMAB في 1.9 milliliters من حمض الخليك الثلجي. لاحظ أن هذا الكاشف يتأثر بالوقت ودرجة الحرارة والضوء، لذا يجب عدم تحضيره مسبقاً.بعد ذوبان DMAB تمامًا، أضف 100 µL من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 10 normal وقم برج العينة باستخدام جهاز vortex. ثم أضف 5 mL من حمض الخليك الثلجي وقم بالرج مجددًا. ولإجراء التفاعل اللوني، انقل 100 µL من كل عينة من القشرة المبردة أو عينة الضابط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 mL.أضف 700 µL من محلول التلوين المُحضّر حديثاً إلى كل عينة. انقل العينات فوراً إلى حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C واحضن العينات لمدة 20 دقيقة بالضبط. بعد فترة الحضن، انقل 200 µL من كل عينة إلى لوح شفاف ذي 96 بئراً.يجب أن يكون لون العينات أصفر في البداية، ولكن سيتحول إلى اللون الأرجواني في حال وجود السكر المختزل، وهو ما يشير إلى وجود القشرة. هنا، لا تظهر العديد من العينات لوناً أرجوانياً مرئياً. ومع ذلك، تبدو عينات 250 و 500 و 5,000 nanomole مختلفة بصرياً عن عينة الضابط السلبي ذات الـ zero nanomole.باستخدام قارئ الأطباق، حدد الامتصاصية عند 585 نانومتر. عند القياس بكثافة ضوئية (OD) تبلغ 585 نانومتر، فإن الإشارة الناتجة عن العينات القياسية تتوافق بشكل أفضل مع الانحدار الخطي. يوضح هذا الجدول النتائج النموذجية باستخدام معايير N-acetylglucosamine.استُخدمت هذه البيانات بعد ذلك لإنشاء منحنى القياس الموضح هنا. أُجري اختبار الإنبات تحت ظروف محفزة للإنبات باستخدام محلول منظم للإنبات مدعوم بـ 100 millimolar glycine و 10 millimolar taurocholic acid. أما في ظروف عدم الإنبات، فقد استُخدم 100 millimolar glycine فقط.في حالة غياب حمض التوروكوليك، لا تنبت أبواغ C.Difficile، ولا يحدث تغيير يذكر في وجود شظايا القشرة في المحلول. ومع ذلك، في وجود كل من حمض التوروكوليك والجليسين، تنبت أبواغ C.difficile وتطلق شظايا القشرة في المحلول. ويُقرأ ذلك على شكل زيادة في قيمة OD585 بمرور الوقت في العينات المتفاعلة.تم حساب كمية شظايا القشرة المتحررة خلال هذا المقايسة باستخدام منحنى قياسي. وكما يتضح هنا في هذه المقايسة، فإن معظم القشرة قد تحللت أو تحررت خلال 15 دقيقة من التعرض للمادة المحفزة للإنبات. وهذا يشير إلى أن معظم الأبواغ قد نبتت في هذا الإطار الزمني.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الكشف عن شظايا القشرة (cortex fragments) أو السكريات المختزلة في محلول الإنبات أثناء إنبات الأبواغ البكتيرية. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم إيلاء اهتمام وثيق لأوقات التفاعل لضمان تطور المقايسة بشكل صحيح.

detecting-cortex-fragments-during-bacterial-spore-germination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

المصدر: فرانسيس ، إم بي ، وآخرون. الكشف عن شظايا القشرة أثناء إنبات الأبواغ البكتيرية. J. Vis. خبرة. (2016).يوضح هذا الفيديو طريقة قياس الألوان للكشف عن تدهور القشرة أثناء إنبات الأبواغ البكتيرية عن طريق قياس إطلاق السكريات المختزلة بمرور الوقت. باستخدام معايير N-acetylglucosamine وعينات النقطة الزمنية ، يحدد الفحص تركيز السكر من خلال تفاعل كروموجينيك أرجواني ، مما يشير إلى مدى التحلل المائي للقشرة.

الكشف اللوني عن تدهور القشرة أثناء إنبات الأبواغ البكتيرية

المصدر: Wen، J.، Pasman، et al.، تصور الجراثيم والغشاء الداخلي في جراثيم العصيات الرقيقة . J. Vis. خبرة. (2019)يوضح هذا الفيديو استخدام الفحص المجهري للإضاءة المنظمة للحصول على صور مضان ثلاثية الأبعاد تكشف عن تنظيم بروتينات الإنبات داخل الأبواغ البكتيرية.

تصور بروتينات الإنبات في الغشاء الداخلي للجراثيم البكتيرية

نحن تصف طريقة لتتبع تمزق endomembrane التي تسببها البكتيريا داخل...

القياسات خلية واحدة من تمزق رغوي الناجمة عن مسببات الأمراض بين الخلايا

البكتيريا تنتج مركبات يفرز التي لديها القدرة على التأثير في علم وظائف الأعضاء من جيرانهم الميكروبية. نحن هنا وصف شاشة coculture التي تسمح الكشف عن مثل هذه التفاعلات بين الأنواع بوساطة كيميائيا عن طريق خلط التربة مع سلالات الميكروبات مراسل النسخي الفلورسنت من العصوية الرقيقة على وسائل الاعلام الصلبة.

باستخدام Coculture لكشف كيميائيا وساطة بين الأنواع التفاعلات

تم تطوير طريقة لتمييز الأبواغ الداخلية البكتيرية من المجتمعات الميكروبية المعقدة لإجراء دراسات مزرعة أو جزيئية مخصصة لهذه المجموعة من البكتيريا.

العزلة المادية من الأبواغ من العينات البيئية التي تستهدف تحلل من الخلايا النباتية

هذا البروتوكول يوضح الخطوات المتتالية الهامة اللازمة لتقييم مدى أهمية رصد المعلمة الحيوية وعمليات إصلاح الحمض النووي في أحياء أبواغ عصيات نجحت بعد العلاج مع انخفاض ضغط البلازما بواسطة تتبع إصلاح الحمض النووي المسمى fluorescence البروتينات عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل] حل الوقت ومسح المجهر الإلكتروني.

التحقيق "تضر الآثار من منخفضة الضغط البلازما التعقيم" على البقاء لجراثيم Bacillus نجحت "باستخدام خلية يعيش مجهرية"

هنا نقدم البروتوكولات للمبتدئ الباحثين لبدء فينوتيبينج لجنس البكتيرية الهامة عقاقيري متسلسلة.

التقييم المرئية والمجهرية من طفرات إنمائية متسلسلة

فطريات التفحم يسبب الكثير من الأمراض الزراعية المدمرة. أنها مشتتة تيليوسبوريس الخاملة التي تنبت في استجابة لمنبهات بيئية. أننا مخطط طريقتين لتقصي التغيرات الجزيئية أثناء الإنبات: قياس زيادة التنفس للكشف عن التنشيط الأيضي وتقييم الأحداث الجزيئية المتغيرة عن طريق عزل تيليوسبوريس في المراحل المورفولوجية المميزة.

التحقيق الإنبات تيليوسبوري باستخدام تحليل ميكروريسبيريشن وميكروديسيكشن

كتلة بروتينات مستقبلات جيرمينانت في 'جيرمينوسوميس' في الغشاء الداخلي للجراثيم العصوية نجحت . يمكننا وصف بروتوكول باستخدام القرار سوبر مجهرية وفلوري البروتينات مراسل لتصور جيرمينوسوميس. ويحدد البروتوكول أيضا مجالات الغشاء الداخلي بوغ ملطخة تفضيلي مع صبغ الغشاء FM4-64.

التصور جيرمينوسوميس و "الغشاء الداخلي" في الجراثيم العصوية نجحت

إن عدوى Caenorhabditis elegans بواسطة الطفيلي المجهري Nematocida parisii تمكن الديدان من إنتاج ذرية شديدة المقاومة لنفس العامل الممرض. هذا مثال على المناعة الموروثة ، وهي ظاهرة جينية غير مفهومة جيدا. يصف هذا البروتوكول دراسة المناعة الموروثة في نموذج دودة قابلة للسحب وراثيا.

دراسة المناعة الموروثة في نموذج Caenorhabditis elegans لعدوى Microsporidia

يركز هذا البروتوكول على استخدام قياس التدفق الخلوي وعد الخرز لتحديد الجراثيم البكتيرية الموسومة ببروميد الإيثيديوم. هذه الطريقة فعالة أيضا لتحليل الاقتران التساهمي للبروتينات على سطح الجراثيم السليمة.

تحسين تعداد بوغ العصوية الرقيقة وتحليل التسمية في قياس التدفق الخلوي

اكتشف طريقة كشف السكريات المختزلة وأجزاء القشرة أثناء إنبات الأبواغ البكتيرية باستخدام Clostridium difficile. تُساعد هذه التقنية الباحثين على فهم ديناميكيات إنبات الأبواغ وعمليات التمثيل الغذائي.

كشف اللحاء شظايا خلال البكتيرية سبور الإنبات

استكشف المزيد من الفيديوهات