كشف اللحاء شظايا خلال البكتيرية سبور الإنبات

الهدف العام من هذا البروتوكول خطوة بخطوة هو تحديد وفرة شظايا القشرة أو تقليل السكريات أثناء إنبات الأبواغ البكتيرية. ستوضح هذه الطريقة بالتفصيل الخطوات المطلوبة للكشف عن وجود شظايا القشرة أو تقليل السكريات أثناء إنبات الأبواغ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن معظم المختبرات لديها الكواشف والمعدات اللازمة لإكمال البروتوكول بنجاح.

ابدأ هذا الإجراء بوضع أنبوب من جراثيم المطثية العسيرة في كتلة تسخين واحتضانها 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، ضع الأنبوب على الجليد. محلول الإنبات خاص بأنواع الأبواغ البكتيرية التي تتم دراستها.

لفحص إنبات بوغ المطثية العسيرة ، نستخدم محلولا من 10 ملليمولار تريس عند درجة الحموضة 7.5 مع 150 ملليمولار من كلوريد الصوديوم ، و 100 ملليمولار جلايسين ، و 10 ملليمولار من حمض التوروكوليك في الماء منزوع الأيونات. قم بإعداد مليلتر واحد من محلول الإنبات لكل عينة بالإضافة إلى مليلتر إضافي. قبل البدء في الفحص ، انقل ملليلترا واحدا من محلول الإنبات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وضعه جانبا.

سيكون هذا بمثابة فراغ للكشف عن شظايا القشرة. بعد ذلك ، إلى محلول الإنبات ، أضف الجراثيم إلى OD600 بحوالي 3.0 ودوامة لفترة وجيزة. تعمل هذه الكمية من الجراثيم بشكل جيد لتخفيف إطلاق شظايا القشرة أثناء إنبات جراثيم المطثية العسيرة.

مباشرة بعد إضافة الجراثيم ، قم بإزالة عينة سعة 1.2 مل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وضعه في جهاز الطرد المركزي. ثم جهاز الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة عند 14 ، 000 مرة G. بعد الدوران ، انقل ملليلترا واحدا من المادة الطافية إلى أنبوب غطاء لولبي جديد سعة ملليلترين وقم بتجميده عند سالب 80 درجة مئوية.

كرر عملية أخذ الحصص ، والدوران لأسفل ، والتجميد على فترات منتظمة حتى يتم جمع العينة لكل نقطة زمنية. نظرا للوقت اللازم للطرد المركزي وأخذ العينات ، لا يمكن إجراء نقاط زمنية أقل من دقيقتين أثناء هذا الإجراء ، لذلك يتم أخذ هذه العينات مرة كل دقيقتين لمدة 14 دقيقة. أثناء تحضير عينات القشرة ، إذا احتاج حمض الديبيكولينيك إلى المراقبة ، فقم بإزالة عينة منفصلة سعة 100 ميكرولتر وتوزيعها في أنبوب طرد مركزي دقيق على الجليد.

قم أيضا بإعداد عينات لتوليد منحنى قياسي بالكميات التالية من N-acetylglucosamine. صفر ، 12.5 ، 25 ، 50 ، 100 ، 250 ، 500 ، و 5 ، 000 نانومول في محلول الإنبات. بعد جمع عينة لكل نقطة زمنية ، قم بإزالة العينات من الفريزر وتجميدها مع عينات المنحنى الفارغة والقياسية.

ثم قم بتخزين جميع العينات عند سالب 80 درجة مئوية حتى الاستخدام. في يوم الفحص ، قم بتعليق العينات المجففة بالتجميد ، بما في ذلك الضوابط وعينات المنحنى القياسية ، في 120 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك مع الفينول وبيتا ميركابتو إيثانول. بعد ذلك ، انقل جميع العينات المعلقة إلى أنابيب غطاء لولبي جديدة سعة ملليلتر.

ثم احتضنها في حمام مائي معاد تدويره عند 95 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بعد الحضانة ، ضع العينات على الثلج حتى تبرد. ثم أضف 120 ميكرولترا من ثلاثة هيدروكسيد الصوديوم المولار لتحييدها.

بعد ذلك ، أضف 80 ميكرولترا من محلول بيكربونات الصوديوم المشبع و 80 ميكرولترا من محلول أنهيدريد الخليك بنسبة 5٪ لكل عينة وقم بدوامها. ثم احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، انقل العينات مرة أخرى إلى حمام مائي 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق بالضبط.

لاحظ أن هذه الخطوة حساسة للوقت ويمكن أن تؤثر الأوقات الأطول على تطوير إشارة المصب. أخرج العينات من الحمام المائي وقم بتبريدها على الثلج. أضف 400 ميكرولتر من رباعي هيدرات البوتاسيوم 6.54٪ إلى كل أنبوب ودوامة.

احتضان العينات في حمام مائي معاد تدويره عند 95 درجة مئوية لمدة سبع دقائق بالضبط. هذه الخطوة حساسة للوقت أيضا. قم بإزالة العينات وضعها على الثلج لمدة خمس دقائق.

أثناء وجود العينات على الجليد ، قم بإعداد كاشف اللون. قم بإذابة 0.320 جرام من DMAB في 1.9 مل من حمض الخليك الجليدي. لاحظ أن هذا الكاشف حساس للوقت ودرجة الحرارة والضوء ولا ينبغي إجراؤه مسبقا.

بعد أن يذوب DMAB تماما ، أضف 100 ميكرولتر من 10 حمض هيدروكلوريك عادي وقم بتدوير العينة. ثم أضف خمسة ملليلتر من حمض الخليك الجليدي والدوامة مرة أخرى. بالنسبة للتفاعل اللوني ، انقل 100 ميكرولتر من كل قشرة مبردة أو عينة تحكم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر.

أضف 700 ميكرولتر من محلول الألوان المحضر حديثا إلى كل عينة. انقل العينات على الفور إلى حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واحتضان العينات لمدة 20 دقيقة بالضبط. بعد الحضانة ، انقل 200 ميكرولتر من كل عينة إلى صفيحة شفافة مكونة من 96 بئرا.

يجب أن تكون العينات صفراء اللون في البداية ولكنها ستتحول إلى اللون الأرجواني في حالة وجود سكر مختزل ، مما يشير إلى وجود القشرة. هنا ، لا تظهر العديد من العينات لونا أرجوانيا مرئيا. ومع ذلك ، فإن عينات 250 و 500 و 5000 نانومول تبدو مختلفة بصريا عن التحكم السلبي صفر نانومول.

باستخدام قارئ الألواح ، حدد الامتصاص عند 585 نانومتر. عند القياس في OD 585 نانومتر ، فإن الإشارة المتولدة من العينات القياسية تناسب الانحدار الخطي بشكل أفضل. يوضح هذا الجدول النتائج النموذجية باستخدام معايير N-acetylglucosamine.

ثم تم استخدام هذه البيانات لإنشاء المنحنى القياسي الموضح هنا. تم إجراء فحص الإنبات في ظل ظروف تعزيز الإنبات مع مخزن مؤقت للإنبات مكمل ب 100 مللي مولار جلايسين و 10 مللي مولار من حمض التوروكوليك. في الظروف غير الإنباتية ، 100 مللي مولار جلايسين فقط.

في حالة عدم وجود حمض التوروكوليك ، لا تنبت جراثيم المطثية العسيرة ، وهناك تغيير طفيف في وجود شظايا القشرة في المحلول. ومع ذلك ، في وجود كل من حمض التوروكوليك والجلايسين ، تنبت جراثيم المطثية العسيرة وتطلق شظايا القشرة في المحلول. يتم امتصاص هذا كزيادة في OD585 بمرور الوقت للعينات المتفاعلة.

تم حساب كمية شظايا القشرة التي تم إطلاقها أثناء هذا الفحص باستخدام منحنى قياسي. كما يتضح هنا في هذا الاختبار ، تم تحلل معظم القشرة أو إطلاقها بعد 15 دقيقة من التعرض للإنبات. يشير هذا إلى أن معظم الجراثيم قد نبتت في هذا الإطار الزمني.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف شظايا القشرة أو تقليل السكريات في محلول الإنبات أثناء إنبات الأبواغ البكتيرية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الانتباه عن كثب إلى أوقات رد الفعل حتى يتطور الاختبار بشكل صحيح.