التقييم المرئية والمجهرية من طفرات إنمائية متسلسلة
سبتمبر 12, 2018
هنا نقدم البروتوكولات للمبتدئ الباحثين لبدء فينوتيبينج لجنس البكتيرية الهامة عقاقيري متسلسلة.
الهدف العام للتقنيات التالية هو تدريب الباحثين المبتدئين على العمل مع Streptomyces والأنواع الأخرى ذات الصلة في مختبر التدريس الجامعي وإعدادات الفصول الدراسية في المدرسة الثانوية. تعتبر الملاحظة المظهرية مهمة للعديد من الباحثين الذين يدخلون مجال أبحاث Streptomyces. يصف هذا الفيديو طرق انتشار البكتيريا وتخزينها والفحص البصري والمجهري.
تستخدم طرق التمثيل الموضحة هنا Streptomyces coelicolor كنموذج. ومع ذلك ، فإن الطرق قابلة للتطبيق على جميع أعضاء الجنس الكبير بالإضافة إلى الشعلات ذات الصلة الوثيقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها مصممة لتكون في متناول الباحثين المبتدئين في الفصل الدراسي في المدرسة الثانوية أو مختبر التدريس الجامعي بالإضافة إلى موظفي المختبرات ذوي الخبرة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو وقراءة البروتوكول المصاحب ، يجب أن يكون الباحثون الجدد قادرين على معالجة سلالات Streptomyces الخاصة بهم ، وتخزينها بشكل صحيح وبدء تجارب التوصيف البصري. سيوضح الإجراءات غاريت كانديل وشون كيرك ، طلاب أبحاث جامعيين من مختبري في جامعة أوتربين. للبدء ، استخدم طريقة قياسية ، مثل طريقة الخط الرباعي الموضحة في Saunders 2012 لرسم سلالات Streptomyces على ألواح أجار MS وثقافتها في مستعمرات واحدة.
كل أربعة إلى ستة أيام ، اختر مستعمرة واحدة وأعد خطها في طبق جديد. مع تقدم المستعمرات في العمر ، تصبح عرضة لطفرة العشوائية. بعد إجراء الطفرات وفقا لبروتوكول النص ، لاحظ مورفولوجيا المستعمرة لكل طفرة مقارنة بسلالة الوالدين من النوع البري.
عند توصيف أنواع Streptomyces الجديدة ، قارن العزلة الجديدة بتلك الموجودة في الأنواع المدروسة جيدا مع ملاحظة الشكل الأساسي وسطح المستعمرة والتعتيم والارتفاع والتصبغ. قم بتسمية صفيحة أجار MS وخط النوع البري والسلالات الطافرة في أنماط الإسفين. كن حذرا من عدم ملامسة أي سلالة سلالة أخرى لتجنب التلوث المتبادل.
لاحظ التاريخ والوقت اللذين يتم فيه وضع السلالات على اللوحة. ثم احتضان الصفائح عند 30 درجة مئوية. تذكر أنه من المهم للغاية دائما حماية عينة Streptomyces من التلوث.
استخدم أفضل تقنية معقمة لجميع الخطوات ، وفتح الألواح والأنابيب لأقل قدر ممكن من الوقت. ضع أطباق بتري المزروعة على ورق ملون أو أبيض لتجانس الخلفية. اكتب على الورقة اسم السلالة والتاريخ ودرجة حرارة الحضانة والوقت من خطوط اللوحة الأولى.
التقط صورا رقمية للوحة مع معلومات الإجهاد المكتوبة على خلفية الورق بحيث يكون الارتباك ضئيلا. قم بتعقيم الملقط عن طريق غسلها في 70٪ من الإيثانول ثم تمريرها عبر لهب موقد بنسن لتبخر الإيثانول. قم بتعقيم أغطية الغطاء عن طريق غسلها في 70٪ من الإيثانول ثم تركها تجف في طبق بتري معقم.
بعد ذلك ، لتحضير رفع غطاء لنمو البكتيريا ، استخدم ملاقط معقمة لالتقاط غطاء معقم ووضع الغطاء على صفيحة أجار MS حيث يكون نمو البكتيريا كثيفا. باستخدام الملقط ، اضغط برفق على الجزء الخلفي من الغطاء لضمان النقل الكافي للجراثيم البكتيرية والفطريات الهوائية. التقط الغطاء من اللوحة وضعه بزاوية 45 درجة مع مواجهة مادة الخلية لسطح شريحة المجهر التي تحتوي على قطرة 15 ميكرولتر من 50٪ جلسرين.
اترك الغطاء يسقط على الجلسرين مما يقلل من فقاعات الهواء. لإجراء الفحص المجهري لتباين الطور على فترات زمنية مختلفة ، ضع الشريحة المعدة على مرحلة المجهر وأضف قطرة من زيت الغمر إلى وسط الغطاء. قم بتدوير هدف الطور 100x في مكانه واضبط برج المكثف على إعداد طور المطابقة المناسب.
بمجرد ملامسة العدسة الشيئية للزيت، استخدم مقبض الضبط الدقيق فقط لتركيز الصورة. افحص العديد من مجالات الرؤية لتمييز الاختلافات الملحوظة والمتسقة بين السلالات الطافرة والنوع البري. مثل القدرة على تكوين الجراثيم وحجم الأبواغ وشكلها والعدد الإجمالي للجراثيم.
باستخدام ملاقط معقمة ، قم بإعداد رفع غطاء من صفيحة أجار MS كما كان من قبل حيث يكون نمو البكتيريا واضحا مع لمس الجزء الخلفي من الغطاء برفق باستخدام الملقط لضمان النقل الكافي للجراثيم البكتيرية والخيوط الهوائية. التقط الغطاء من اللوحة وضعه على مخزون البطاقات بحيث يكون الجانب الذي يحتوي على مادة الخلية متجها لأعلى لسهولة ومعالجة الغطاء. باستخدام الميثانول المثلج ، اغمر الغطاء واتركه لمدة خمس دقائق.
باستخدام PBS ، اغسل الغطاء مرتين عن طريق الاستغناء عن المحلول وإزالته برفق. أضف 15 ميكرولترا من محلول يوديد البروبيديوم 10 ميكروغرام لكل مليلتر و أو 10 ميكروغرام لكل مليلتر من WGA-FITC إلى شريحة. ضع الغطاء ووجهه لأسفل على قطرة من البقعة الفلورية.
احتضان العينات في غرفة مظلمة أو مضاءة بشكل خافت لمدة 15 دقيقة. يجب حماية مخزونات البقع الفلورية وعينات البقع من الضوء. يوصى بأن يستخدم الباحثون ظروف الإضاءة المنخفضة أثناء تحضير العينات واستخدام صندوق مظلم لاحتفاظ بالعينات بمجرد تحضيرها.
راقب الشرائح تحت عدسة موضوعية 100x باستخدام مجهر تباين الطور أو DIC المجهز بمكعبات إثارة epifluorescence للبروبيديوم يوديد و FITC. قم بتحليل الصور وفقا لبروتوكول النص. تظهر هنا أمثلة على طفرات Streptomyces الناتجة عن طفرات الينقولات.
قد تشير الفطريات الهوائية ذات اللون الفاتح إلى انخفاض مستوى الصبغة الرمادية الناجمة عن عيب في الأبواغ. أو عدم وجود مظهر غامض يدل على وجود كتلة في تكوين الفطريات الهوائية. كما يتضح من الفحص المجهري للتباين الطوري ، تنتج مستعمرات S.coelicolor من النوع البري عادة فطريات هوائية بحوالي يومين من النمو.
وسلاسل طويلة من الجراثيم بثلاثة أيام من النمو. قد تتأخر الطفرات البيضاء في تكوين الأبواغ ، أو تظهر انخفاضا في وفرة الجراثيم المنتجة ، أو تنتج جراثيم ذات عيوب في الشكل و / أو الحجم أو ببساطة تنتج مستويات أقل من صبغة الأبواغ الرمادية الناضجة. يظهر هنا باستخدام DIC والفحص المجهري الفلوري مع تلطيخ PI ، تتم مقارنة التلوين المتباعد بانتظام لسلسلة من الجراثيم في عينة من النوع البري بنمط التلوين المتقطع لاثنين من طفرات إدخال الينقولات التي تظهر عيبا في فصل الكروموسومات.
باستخدام WGA-FITC لتلطيخ جدار الخلية ، توجد سلالة S.venezuelae من النوع البري كخيوط هوائية ناعمة بين سلاسل الجراثيم. ويعرض مجموعة جانبية مثل الحاجز الانقسام التي تظهر عادة أثناء التبوغ. يختلف العمل مع كائن حي خيطي اختلافا كبيرا عن العمل مع بكتيريا معروفة على شكل قضيب.
يجب أن تكون بروتوكولات الفيديو هنا بمثابة مورد مهم للباحثين الجدد الذين يدخلون مجال أبحاث Streptomyces. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية البدء في دراسة أنواع Streptomyces والبكتيريا الأخرى ذات الصلة. بعد هذه التجارب الأولية، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات في مختبر الأبحاث لمعرفة المزيد عن سلالات Streptomyces.
على سبيل المثال ، قد تكون بعض التقنيات المتقدمة عبارة عن علامات على البروتين أو تحليلات التعبير الجيني مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي وتسلسل الحمض النووي الريبي. تستخدم تجارب التنميط الظاهري الأولية لتحديد وتوصيف السلالات الجديدة وتمييز الدور النموذجي لجين معين. تم استخدام هذه الأساليب بالفعل في مختبرات التدريس الجامعية لتحديد وتوصيف مجموعة متنوعة من سلالات Streptomyces.
نظرة عامة
يعرض هذا المقال البروتوكولات المصممة للباحثين المبتدئين لبدء التعرف على نوع Streptomyces الجرثومي. ويؤكد على أهمية الملاحظة الظاهرية في أبحاث Streptomyces ويقدم طرقًا لانتشار البكتيريا وفحصها.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- علم الوراثة
- تقنيات المختبرات
الخلفية
- Streptomyces هو جنس جرثومي ذو أهمية دوائية.
- التعرف على النمط الظاهري ضروري للباحثين الجدد في هذا المجال.
- الطرق قابلة للتطبيق في كل من البيئات التعليمية والبحثية.
- Streptomyces coelicolor بمثابة كائن حي نموذجي.
غرض الدراسة
- تدريب الباحثين المبتدئين على التعامل مع Streptomyces.
- توفير تقنيات سهلة الوصول للتعامل مع البكتيريا وتحديد خصائصها.
- تسهيل الفحص البصري لسلالات البكتيريا.
الطرق المستخدمة
- طريقة رسم الأرباع لزراعة سلالات Streptomyces.
- فحص مجهريّ للنمو الجرثومي.
- استخدام تقنيات التلطيخ الفلوري.
- مجهر التباين الطور لملاحظة مفصلة.
النتائج الرئيسية
- تم توضيح الإجراءات الصحيحة لمعالجة السلالات وتخزينها.
- تم تحديد الاختلافات المورفولوجية بين السلالات الطبيعية والطفرة.
- تم توفير إرشادات لتجنب التلوث أثناء التجارب.
- تم استعراض تأثير التطفر على خصائص Streptomyces.
الاستنتاجات
- يمكن أن تعزز البروتوكولات سهلة الوصول من تدريب الباحثين المبتدئين.
- التعرف البصري ضروري لفهم بيولوجيا Streptomyces.
- التقنيات الصحيحة تضمن نتائج موثوقة في أبحاث البكتيريا.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Visual and microscopic phenotyping of Streptomyces developmental mutants provides foundational data for early-stage target validation and mechanistic de-risking in antibiotic discovery. Standardized characterization of mutant strains supports predictive confidence in linking genotype to phenotype, which is critical for prioritizing biosynthetic pathways and functional targets. These methods enable reproducible, scalable workflows that underpin portfolio decisions in natural product R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of gene function through observable phenotypic changes.
- Supports biological de-risking by distinguishing developmental defects from wild-type characteristics.
- Facilitates functional target validation by correlating genetic mutations with developmental outcomes.
- Provides a reproducible framework for triaging candidate strains in natural product pipelines.
Screening & Assay Development
- Establishes validated visual and microscopic criteria for mutant selection in screening campaigns.
- Standardizes phenotypic endpoints for reproducibility across research teams and timepoints.
- Enables quantitative assessment of colony morphology, sporulation, and pigmentation for downstream assays.
- Prepares characterized strains for integration into high-throughput or secondary screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic data with biosynthetic pathway analysis for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of strains with desirable developmental profiles.
- Provides mechanistic insight into gene function relevant to secondary metabolite production.
- Facilitates the identification of translational biomarkers linked to developmental phenotypes when supported by further analysis.
Pipeline & Workflow Integration
Phenotypic evaluation of Streptomyces mutants is positioned at the interface of early discovery and lead identification, providing critical data for hypothesis testing and pathway prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven investigation of gene function and developmental pathways.
- Screening: Delivers standardized, reproducible phenotypic endpoints for mutant selection.
- Analytics: Enables quantitative comparison of morphological and microscopic features across strains.
- Translational Research: Lays the groundwork for linking developmental phenotypes to biosynthetic output.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, adaptable protocol for ongoing strain characterization and portfolio expansion.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in genotype-phenotype relationships and target validation.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in strain characterization workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in natural product pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains and biosynthetic pathways for further development.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in sterile technique and basic microbiological methods.
- Needs access to phase contrast or DIC microscopy and fluorescence imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of phenotypic scoring and documentation practices.
- Adaptable to a range of Streptomyces species and related actinomycetes with minor protocol adjustments.
- Dependent on consistent environmental and incubation conditions to ensure reproducibility.
