التحقيق الإنبات تيليوسبوري باستخدام تحليل ميكروريسبيريشن وميكروديسيكشن

الهدف العام للإجراءات المعروضة هنا هو تحديد مراحل إنبات الأبواغ بحيث يمكن تقييم مستويات النسخ الجيني. سيوفر تحليل هذه التغييرات مزيدا من المعرفة بالمرحلة الحرجة في انتشار المرض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول التحولات أثناء إنبات الأبواغ التيليوسبورية المرتبطة بالتغيرات في مستويات النسخ الجيني وبالتالي تعكس التحولات في التحكم في التعبير الجيني.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تحدد التحولات في مستوى التنفس التي لا تتوافق مع المفاتيح المورفولوجية المرئية وتسمح بالعزل المادي للأبواغ المرئية في مراحل إنبات متميزة. هذه التقنية لها آثار على التحكم في انتشار مسببات الأمراض ، لأنها تسمح لنا بتحديد التحولات الرئيسية في إنبات الأبواغ ، والتي ، إذا تم تغييرها ، يمكن أن تمنع انتشار المرض. ابدأ هذا الإجراء بعدوى كوز الذرة ، وحصاد الأبواغ التيليوبورية ، بالإضافة إلى اختبار صلاحية الأبواغ التيليوناسبورية والإنبات ، كما هو موضح في بروتوكول النص.

للحث على الإنبات ، قم أولا بوزن كمية متساوية من الأبواغ التيليوسبورية لكل تجربة تنفس. في خزانة السلامة الحيوية ، أضف الأبواغ إلى غرفة التنفس المعقمة. املأ الغرفة بمرق سكر العنب بالبطاطس ، مع كبريتات الستربتومايسين وكبريتات الكاناميسين.

الماصة لأعلى ولأسفل لإنشاء تعليق تيليوسبور. ضع غطاء الغرفة في الغرفة لإنشاء ختم محكم الغلق. للحصول على قياس التعرف الضوئي على الحروف ، ضع الغرفة أولا في رف الغرفة داخل حمام مائي.

ثم ضع مسبار الأكسجين داخل فتحة الغرفة. راقب نقاط البيانات التي تظهر في الوقت الفعلي على برنامج معدل تتبع المستشعر. دع المسبار يستقر لمدة ثلاث دقائق تقريبا بعد وضع المسبار في الغرفة.

انقر فوق قياس لقياس مستويات الأكسجين بشكل مستمر لمدة ست ساعات مع تسجيل القياسات بفواصل زمنية مدتها ثانيتين. أوقف القياس وكرر هذه الخطوات لكل عينة ليتم تحليلها قبل تصدير البيانات إلى Microsoft Excel وإجراء تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع ما يقرب من 10 ملليغرام من الأبواغ الرقيقة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

قم بتعليق الأبواغ التيليوسبورية في 500 ميكرولتر من PDB مكملة بكبريتات الستربتومايسين. ماصة برفق للخلط حتى تختفي كتل من الأبواغ في الوسط. انقل معلق التيليونبور إلى قارورة Erlin Meyer سعة 250 ملليلتر ، تحتوي على PDB ، مكملة بكبريتات الستربتومايسين.

احتضن القارورة طوال الليل عند 28 درجة مئوية ، واهتز بسرعة 90 دورة في الدقيقة. قم بإعداد طبق بتري عن طريق سحب أربع إلى خمس قطرات من الماء المقطر سعة خمسة ميكرولتر عبر الجزء العلوي من طبق بتري. بعد ذلك، قم بعمل ثلاث قطرات سعة ميكرولتر من محلول تثبيت الحمض النووي الريبي على طبق بتري لاستخدامها في جمع العينات.

أيضا ماصة 30 قطرة من خمسة ميكرولتر من الأبواغ النابتة على طبق بتري. أضف 15 مل من الزيت المعدني إلى طبق بتري. تأكد من تغطية جميع القطرات بالزيت قبل المتابعة.

بعد ذلك ، قم بإعداد الشعيرات الدموية الدقيقة بقطر 15 ميكرون ، وشفة ملليمتر واحد ، وطول 55 مليلتر ، وزاوية طرف 20 درجة. ضعه في حامل الشعيرات الدموية الدقيقة ، واغمره في الزيت المعدني ، حيث يسمح عمل الشعيرات الدموية للزيت المعدني بدخول الشعيرات الدموية الدقيقة. حرر الضغط في الشعيرات الدموية الدقيقة قبل إحضاره إلى قطرة الماء.

الشفط لتحضير الشعيرات الدموية بالماء. باستخدام أدوات التحكم في المعالج الدقيق ، انقل الشعيرات الدموية الدقيقة المحضرة إلى إحدى قطرات الإنبات ، واخترق القطرة. قم بخفض الشعيرات الدموية الدقيقة ، وارفع فم الشعيرات الدموية الدقيقة إلى تيليوبوغ ينبت في مرحلة إنبات الاهتمام.

استنشق ببطء من أجل التقاط تيليوسبور النابت. توقف عن الشفط بمجرد دخول التيليوسبور إلى الشعيرات الدموية الدقيقة. كرر حتى يكون هناك ما يقرب من خمسة تيليوسبواغ في الشعيرات الدموية الدقيقة.

ارفع الشعيرات الدموية الدقيقة باستخدام المشغل الدقيق وأحضرها إلى قطرة التجميع لمحلول تثبيت الحمض النووي الريبي. اخترق القطرة ، وحقن الأبواغ في القطرة. كرر هذه الخطوات حتى يتم التقاط ما يقرب من 1,000 تيليوسبور.

لاستعادة قطرة التجميع ، قم برفع قطرة التجميع ، وانقلها إلى غطاء أنبوب الحمض النووي الريبي المجاني 2.0 ملليلتر من microcenterfuge. بعناية الزيت المعدني مع الماصة ، دون إزعاج قطرة التجميع. يمكن الآن استخدام الأبواغ التيليوسبواغية لتطبيقات المصب مثل عزل الحمض النووي الريبي.

توضح هذه المؤامرة نتيجة نموذجية من تقييم التغيرات في مستوى الأكسجين في معلقات الأبواغ التيليوسبواغية المستحثة على الإنبات. بالنسبة للأبواغ التيليونية غير المستحثة ، يحدث الفصل الذي يشير إلى بدء التنفس في حوالي 30 دقيقة. بالنظر إلى أن إعداد العينة ونقلها إلى مسبار الأكسجين يستغرق حوالي 15 دقيقة ، فإن هذه المرة هي في الواقع 45 دقيقة.

كما هو موضح هنا ، هي المراحل الخمس لإنبات الأبواغ التيليوبورية. في المرحلة الأولى ، يتم تحفيز الأبواغ على الإنبات ولكن لا تظهر أي علامة مورفولوجية على الإنبات. تظهر الأبواغ التيليوسبورية المرحلة الثانية بروميسليوم ناشئة بطول أقل من قطر الأبواغ.

في المرحلة الثالثة ، يكون طول البروميسليوم أكبر من قطر الأبواغ. تتميز المرحلة الرابعة بالفطريات مع الأبواغ القاعدية المرفقة. وفي المرحلة الخامسة ، هناك الأبواغ القاعدية الناشئة.

هنا ، يتم عرض الأبواغ النابتية بشكل غير متزامن ويتم وضع الشعيرات الدموية الدقيقة بالقرب من المرحلة الثالثة من الأبواغ التيليومية. ثم يتم شفط تيليوسبور المرحلة الثالثة في الشعيرات الدموية الدقيقة ونقلها إلى قطرة من محلول التجميع. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام تقنية التشريح المجهري هذه لعزل 1000 من الأبواغ التليوغرافية الخاصة بالمرحلة في ست إلى سبع ساعات.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أخذ فترات راحة متكررة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الجراثيم جسديا في مراحل إنبات متميزة شكليا. وتحديد توقيت بدء التنفس.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة ، بسبب الحاجة إلى الحفاظ على العقم. والحاجة إلى الصبر وعزل أنواع الخلايا عن طريق التشريح المجهري. يمهد تطوير هذه التقنية الطريق لعلماء أمراض النباتات الفطرية لاستكشاف الجوانب المورفولوجية والجزيئية للإنبات في فطريات التفحم والصدأ المدمرة التي تهدد الأمن الغذائي العالمي.

على الرغم من أن هذه التقنية تنطبق علينا نحن علماء الليجوماتيين ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا في العديد من مسببات الأمراض الأخرى للمحاصيل الزراعية المدمرة التي تؤدي إلى خسائر بمليارات الدولارات سنويا. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل عزل الحمض النووي الريبي للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ، ما هو ملف تعريف وتوقيت تغيير مستوى النص؟