تنفيذ نظام العدوى أساس إدراج-نافذ غشاء لدراسة آثار يفرز البكتيرية السموم على خلايا المضيف الثدييات

الهدف العام من نظام العدوى القائم على إدراج الغشاء القابل للاختراق هو دراسة آثار سموم البكتيريا المفرزة على الخلايا المضيفة أثناء الإصابة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تفاعلات المضيف ومسببات الأمراض ، مثل كيفية مساهمة المكونات البكتيرية المفرزة المحددة في استجابات الخلايا المضيفة أثناء العدوى البكتيرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدراسة مكونات البكتيريا المفرزة ، وتقوم عن كثب بنمذجة بيئة مسببات الأمراض المضيفة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في سياق العدوى البشرية.

ستظهر الإجراء ريبيكا فلاهيرتي ، طالبة دراسات عليا في مختبري. لتحضير سلالات متساوية الجين من النوع البري من المجموعة A ، أو GAS ، و GAS M1T1 5448 ، ابدأ المزارع السائلة بين عشية وضحاها عن طريق تلقيح خمسة إلى 10 ملليلتر من مرق تود هيويت واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. الطرد المركزي للثقافات البكتيرية بين عشية وضحاها واستخدم الحجم الأصلي للوسط البكتيري الطازج لإعادة تعليق الحبيبات.

بعد ذلك ، قم بتطبيع الثقافات البكتيرية لتساوي تركيزات البداية عن طريق تخفيف الثقافات المعاد تعليقها في وسط إضافي للوصول إلى نفس OD600. لجمع المحللات لإجراء تحليل الإشارات وفحوصات تحديد ATP ، قم بلوحة خلايا HaCaT في أطباق من ستة آبار بكثافة جلوس تبلغ حوالي ثلاثة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر ، والثقافة إلى 90٪ التقاء. لإجراء مقايسات نفاذية غشاء الإيثيديوم المتجانس وإطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات ، قم بلوحة خلايا HaCaT في 24 طبقا بئرا بكثافة جلوس تبلغ حوالي خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر ، وتنمو إلى 90٪ من التقاء.

قبل العلاج مباشرة ، استخدم 1x PBS لغسل الخلايا. ثم ضع ملليلترين من وسط النمو الطازج مع أو بدون علاج دوائي على الألواح المكونة من ستة آبار ، أو 0.5 مل من الوسط على آبار ألواح 24 بئرا. بعد ذلك ، تحت غطاء التدفق الصفحي ، استخدم ملقطا معقما لوضع غشاء معقم قابل للاختراق بعناية 0.4 ميكرون في كل بئر.

التعامل اللطيف والمعقم مع الإدخالات القابلة للاختراق أثناء تحضير العدوى أمرا بالغ الأهمية لمنع الغشاء من التعرض للخطر أو التلوث أثناء هذه العملية. ضع وسط مزارع الخلايا الطازجة على الغرفة العلوية لكل بئر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بتطبيق حجم مناسب من الثقافات البكتيرية الطبيعية على الغرفة العلوية لنظام إدخال الغشاء المنفذ ، وقم بتطبيق الوسط البكتيري على آبار التحكم.

الإضافة الدقيقة للبكتيريا إلى الغرفة العلوية ، وكذلك النقل اللطيف للخلايا المصابة إلى الحاضنة ، أمرا بالغ الأهمية ، لأنه من الضروري ألا تلوث البكتيريا الغرفة السفلية أثناء الإعداد التجريبي. لتقييم البروتينات المضيفة المفرزة ، استخدم ملقطا معقما لإزالة حشوة الغشاء النفاذة بعناية. بعد ذلك ، مع عدم إزعاج الطبقة الأحادية للخلايا ، اجمع الوسط من الغرفة السفلية إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر.

الطرد المركزي للعينات عند 14,000 RCF وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لحبيبات الحطام الخلوي. بعد ذلك ، قم بإزالة كل المادة الطافية باستثناء 50 ميكرولترا ، وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل ، وخزنها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر ، أو استخدمها على الفور. لتقييم محللات الخلية المضيفة ، قم بشفط الوسط برفق فوق الطبقة الأحادية دون إزعاج الخلايا المضيفة.

ثم استخدم PBS لشطف الخلايا مرة واحدة. قم بشفط PBS برفق ، وقم على الفور بتطبيق حجم من المخزن المؤقت للتحلل المثلج لتحقيق ، على سبيل المثال ، تركيز بروتين يتراوح من 0.5 إلى 1.5 ملليغرام لكل ملليلتر. ثم احتضان العينات على الجليد لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، استخدم مكشطة خلية لفصل الخلايا عن سطح اللوحة لكل بئر ، ونقل محتويات كل بئر بالكامل إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. ثم قم بالطرد المركزي للعينات عند 14،000 RCF وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. لتقييم مكونات اللايستات القابلة للذوبان ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، وخزنها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر ، أو استخدمها على الفور.

لتقييم مكونات المحللة النووية أو غيرها من المكونات غير القابلة للذوبان ، احتفظ بالحبيبات وخزنها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر ، أو استخدمها على الفور. للتقييم عن طريق التصوير المناعي الفلوري ، قم بشفط الوسط واستخدم 1x PBS بارد لغسل الخلايا. ثم ، باستخدام 4٪ PFA و PBS ، قم بإصلاح الخلايا بين عشية وضحاها.

إجراء المزيد من التحليلات وفقا لبروتوكول النص. توضح بيانات اللطخة الغربية الموضحة هنا تنشيط كيناز p38 MAP المحسنا بشكل كبير والخلايا الكيراتينية في وجود سلالات الغاز المنتجة للستربتوليسين S أو SLS ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام هذا النظام لتقييم التغييرات في تنشيط بروتينات إشارات المضيف المستقلة عن الاتصال. في هذا الشكل ، يظهر التنشيط المعتمد على SLS للوسيط الالتهابي الرئيسي العامل النووي كابا ب ، الذي ينتقل من السيتوبلازم إلى النواة عند التنشيط ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام هذا النظام لتصور تأثيرات العوامل البكتيرية المفرزة على استجابات البروتين المضيف باستخدام مناهج الفحص المجهري المناعي.

هنا ، يتم إثبات زيادات كبيرة في كل من نفاذية الغشاء وفي إطلاق LDH من الخلايا المضيفة بعد التعرض لسلالات الغاز المنتجة ل SLS ، مقارنة بالخلايا غير المصابة أو الخلايا المعرضة لسلالة ناقصة SLS. تشير هذه النتائج إلى أن هذا النظام يمكنه تقييم التغيرات المعتمدة على السموم في السمية الخلوية للمضيف. في هذه التجربة ، تم تحديد مستويات ATP في الخلايا الكيراتينية والاستجابة للعدوى بالغاز.

16 ساعة من الإصابة ، لوحظ انخفاض كبير في ATP ، وكان فقدان ATP أكثر وضوحا في وجود SLS ، بما يتفق مع الزيادات المعتمدة على السموم في إشارات الاستجابة للإجهاد المضيف والسمية. بمجرد إنشائها ، يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة الاستجابات المحددة لأي عامل ميكروبي مفرز على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المضيفة. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم ممارسة تقنية معقمة طوال خطوات الإعداد التجريبي ، والحفاظ على التعامل الدقيق مع إدخالات الغشاء القابلة للاختراق ، سواء أثناء الإعداد الأولي أو أثناء جمع العينات.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق مثل النشاف الغربي ، والتصوير المناعي ، ومقايسات نفاذية الغشاء ، من أجل تحديد كيف يساهم العامل البكتيري ذي الأهمية في التغيرات في شلالات الإشارات ويؤثر على السمية الخلوية الكلية أثناء الإصابة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عينات من الخلايا المضيفة لتقييم مجموعة متنوعة من استجابات الخلية المضيفة بعد التعرض لعامل بكتيري مفرز معين ذي أهمية. لا تنس أن التعامل مع المواد الخطرة بيولوجيا ، مثل مسببات الأمراض البكتيرية ، يتطلب اعتبارات أمان معينة.

الاستخدام المناسب لنظارات السلامة والقفازات ومعاطف المختبر ، جنبا إلى جنب مع الاستخدام السليم لغطاء السلامة البيولوجية ، أمرا ضروريا لإجراء هذه التجارب بأمان.