الكشف عن أشكال معدلة من السيتوزين عن طريق الحساسة المناعية

الهدف العام من هذا البروتوكول الكيميائي المناعي هو تقييم التوزيع المكاني للأشكال المعدلة من السيتوزين في مختلف الأنسجة والسياق الخلوي بناء على استخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع البيروكسيديز وتضخيم إشارة التيراميد. تتغلب هذه الطريقة على قيود التقنيات الأخرى التي لا توفر المعلومات المكانية اللازمة لفهم الوظيفة البيولوجية للأشكال المعدلة من السيتوزين. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح هذه الطريقة بالكشف المشترك عن الأشكال المعدلة من السيتوزين مع علامات سلالة البروتين ويمكن استخدامها لدراسة توطينها النووي.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإصلاح أقسام الأنسجة المعاد ترطيبها من أجنة الفئران CD1 من النوع البري وأنسجة المخ البالغة عن طريق وضعها إما في مثلج بارد 4٪ PFA أو 4٪ FA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة المثبت الزائد عن طريق غسل الأقسام في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم باختراق أقسام الأنسجة عن طريق وضعها في وعاء Coplin مملوء ب PBX لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإزالة PBX الزائد عن طريق غسل الأقسام قريبا في PBT. الآن ، ضع الأقسام المنفذة في 2 N HCl لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإهمال الحمض النووي. بعد ذلك ، انقل الأقسام إلى 10 مللي مولار Tris-Hcl لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتحييد حمض الهيدروكلوريك.

بدلا من ذلك ، اغسل الأقسام ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها في PBS. احتضان الأقسام في PBT لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة السائل بعناية من المنطقة المحيطة بأقسام الأنسجة.

في غضون ذلك ، حافظ على رطوبة أقسام الأنسجة. استخدم قلم حاجز مسعور لتطويق الأقسام دون لمسها. بعد ذلك ، احتضان الأقسام في 100 ميكرولتر من محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة.

بعد ذلك ، قم باحتضان أقسام الأنسجة في 100 ميكرولتر من تخفيف 1: 5000 من الجسم المضاد الأساسي أحادي النسيلة للفأر المضاد ل 5hmC وتخفيف 1: 1000 من الجسم المضاد الأساسي متعدد النسيلة للأرانب المضاد ل 5caC في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك ، قم بإجراء الحضانة طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة الأجسام المضادة الزائدة عن طريق غسل الأقسام في وعاء كوبلين مملوء ب PBT ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإزالة PBT الزائد ، وإذا لزم الأمر ، قم بتطويق الأقسام مرة أخرى بقلم حاجز كاره للماء لأن PBT يحتوي على منظف يمكن أن يضعف الحاجز الكارهة للماء. بعد ذلك ، قم بعمل تخفيف 1: 400 من الجسم المضاد المترافق HRP للماعز وتخفيف 1: 400 من الجسم المضاد المترافق 555 للحمار المضاد للفأر في محلول الحظر. ثم احتضان أقسام الأنسجة في 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة.

بعد ذلك ، اغسل أقسام المناديل في وعاء كوبلين مملوء ب PBT ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة. ثم انقل أقسام الأنسجة إلى 100 ميكرولتر من التيراميد عند تخفيف 1: 200 في المخزن المؤقت لتضخيم إشارة التيراميد لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. كان وقت الحضانة هو أنه يجب تحسين محلول التيراميد تجريبيا لكل دفعة فردية من مجموعة تضخيم إشارة التيراميد حيث يتم ملاحظة علاقة خطية بين شدة الإشارة ومدة تضخيم الإشارة القائمة على التيراميد.

بعد ذلك مباشرة ، قم بإزالة محلول التيراميد الزائد عن طريق غسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها في PBT. قم بإزالة PBT الزائد بعناية وقم بتغطية الأقسام على الفور بقطرة من وسط التثبيت. ضع برفق زلة غطاء على أقسام المناديل وأغلق زلة الغطاء بطلاء الأظافر.

ثم احتفظ بأقسام الأنسجة عند أربع درجات مئوية لعدة ساعات قبل الفحص المجهري. لتحديد توزيع 5hmC في أقسام أنسجة المخ ، تم إجراء الكشف المشترك عن هذا التعديل اللاجيني باستخدام علامة للخلايا العصبية بعد الانقسام ، NeuN. كشف التحليل الكيميائي المناعي أنه في حين أن تلطيخ 5hmC البارز متساهم مع الخلايا الإيجابية NeuN ، فإن الخلايا الدبقية السلبية NeuN تمتلك مستويات أقل من 5hmC الجينومية.

لتحديد توزيع 5caC في تمايز الخلايا الجذعية العصبية ، تم إجراء مزامنة هذه العلامة باستخدام علامة دبقية ، GFAP ، على الثقافات الثابتة للخلايا الجذعية العصبية بعد ثلاثة أيام من تحريض التمايز الدبقي. على عكس الخلايا الجذعية العصبية أو الخلايا النجمية الناضجة ، لوحظت إشارة 5caC قوية في نسبة كبيرة من الخلايا التي تعبر عن GFAP. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون جميع الكواشف والمواد مع عيناتك جاهزة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء التصوير متحد البؤر من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول التوزيع النووي للأشكال المعدلة من السيتوزين. هذا يمكن أن يساهم في فك رموز وظيفتها البيولوجية المحتملة.

لا تنس أن العمل مع 2 N Hcl يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل خزانة الأمان والملابس الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.