الكشف عن أشكال معدلة من السيتوزين عن طريق الحساسة المناعية

الهدف العام من هذا البروتوكول الكيميائي المناعي هو تقييم التوزيع المكاني للأشكال المعدلة من السيتوزين في سياقات نسيجية وخلوية متنوعة، وذلك بالاعتماد على استخدام أجسام مضادة ثانوية مقترنة بإنزيم البيروكسيداز وتضخيم الإشارة باستخدام التيراميد. تتغلب هذه الطريقة على قصور التقنيات الأخرى التي لا توفر المعلومات المكانية الضرورية لفهم الوظيفة البيولوجية للأشكال المعدلة من السيتوزين. بالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه الطريقة بالكشف المشترك عن الأشكال المعدلة من السيتوزين مع علامات السلالة البروتينية، ويمكن توظيفها لدراسة تموضعها النووي.

لبدء هذا الإجراء، قم بتثبيت مقاطع نسيجية تمت إعادة ترطيبها من أجنة فئران CD1 من النوع البري وأنسجة دماغ بالغة عن طريق وضعها في 4%PFA أو 4%FA مبردة بالثلج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تخلص من المثبت الزائد عن طريق غسل المقاطع في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، قم بنفاذية المقاطع النسيجية بوضعها في جرة Coplin مملوءة بـ PBX لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بإزالة فائض PBX عن طريق غسل المقاطع لفترة وجيزة في PBT. الآن، ضع المقاطع المنفذة في 2 N HCl لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة البيورين من DNA. ثم، انقل المقاطع إلى 10 millimolar Tris-Hcl لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمعادلة HCl.

بدلاً من ذلك، اغسل المقاطع ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة باستخدام PBS. قم بحضن المقاطع في PBT لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإزالة السائل بعناية من المنطقة المحيطة بمقاطع الأنسجة.

في غضون ذلك، حافظ على رطوبة قطاعات الأنسجة. استخدم قلم حاجز كاره للماء لإحاطة القطاعات دون لمسها. بعد ذلك، قم بتحضين القطاعات في 100 microliters من محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة داخل غرفة رطبة.

بعد ذلك، يتم تحضين قطاعات الأنسجة في 100 µL من تخفيف 1:5000 من الجسم المضاد الأولي monoclonal anti-5hmC للفأر وتخفيف 1:1000 من الجسم المضاد الأولي polyclonal anti-5caC للأرنب في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء التحضين طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، يتم إزالة الأجسام المضادة الزائدة عن طريق غسل القطاعات في جرة Coplin مملوءة بمحلول PBT ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بإزالة فائض PBT، وإذا لزم الأمر، قم بتحديد المقاطع مرة أخرى باستخدام قلم حاجز كاره للماء لأن PBT يحتوي على منظف يمكن أن يضعف الحاجز الكاره للماء. تلي ذلك عملية تخفيف الجسم المضاد goat anti-rabbit HRP-conjugated بنسبة 1:400، وتخفيف الجسم المضاد donkey anti-mouse 555-conjugated بنسبة 1:400 في محلول الحجب. ثم يتم تحضين مقاطع النسيج في 100 microliters من خليط الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة داخل غرفة رطبة.

بعد ذلك، تُغسل قطاعات الأنسجة في جرة كوبلن (Coplin jar) مملوءة بمحلول PBT ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل مرة في درجة حرارة الغرفة. ثم تُنقل قطاعات الأنسجة إلى 100 µL من التيراميد (tyramide) بتخفيف 1:200 في محلول منظم تضخيم إشارة التيراميد لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. يجب تحسين وقت تحضين محلول التيراميد تجريبياً لكل دفعة فردية من طقم تضخيم إشارة التيراميد، حيث يتم ملاحظة علاقة خطية بين شدة الإشارة ومدة تضخيم الإشارة القائم على التيراميد.

مباشرة بعد ذلك، تخلص من محلول التيراميد الزائد عن طريق غسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة باستخدام PBT. قم بإزالة PBT الزائد بعناية وقم بتغطية المقاطع فوراً بقطرة من وسط التثبيت. ضع شريحة غطاء برفق فوق مقاطع الأنسجة وقم بإغلاق شريحة الغطاء باستخدام طلاء الأظافر.

بعد ذلك، تُحفظ قطاعات الأنسجة عند درجة حرارة 4 °C لعدة ساعات قبل الفحص المجهري. ولتحديد توزيع 5hmC في قطاعات أنسجة الدماغ، تم إجراء كشف مشترك لهذا التعديل فوق الجيني مع NeuN، وهو مؤشر للخلايا العصبية بعد الانقسام الفتيلى. وقد كشف التحليل الكيميائي النسيجي المناعي أنه بينما تزامنت صبغة 5hmC البارزة مع الخلايا الموجبة لـ NeuN، فإن الخلايا الدبقية السالبة لـ NeuN كانت تمتلك مستويات أقل من 5hmC الجينومي.

لتحديد توزيع 5caC في الخلايا الجذعية العصبية المتمايزة، تم إجراء صبغ مشترك لهذا الوسم مع وسم دبقي، وهو GFAP، على مستنبتات مثبتة من الخلايا الجذعية العصبية بعد ثلاثة أيام من تحفيز التمايز الدبقي. وبخلاف ما لوحظ في الخلايا الجذعية العصبية أو الخلايا النجمية الناضجة، تم رصد إشارة 5caC قوية في نسبة كبيرة من الخلايا التي تعبر عن GFAP. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون ثماني ساعات تقريباً إذا نُفذت بشكل صحيح.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تجهيز جميع الكواشف والمواد جنباً إلى جنب مع العينات. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن إجراء التصوير البؤري (confocal imaging) للإجابة على أسئلة إضافية حول التوزيع النووي للأشكال المعدلة من السيتوزين. ويمكن أن يساهم ذلك في فك رموز وظيفتها البيولوجية المحتملة.

لا تنسَ أن العمل باستخدام 2 N Hcl يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل استخدام خزانة السلامة وارتداء الملابس الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.