تحديد البروتينات ملزمة جزيء صغير في الخلوي البيئة الأصلية التي تعيش خلية Photoaffinity وصفها

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد البروتينات المرتبطة بالجزيئات الصغيرة باستخدام مسبار التقارب الضوئي ، والذي يمكن أن يرتبط بهدفه في الخلايا الحية ، مما يسمح بعزل الهدف وتحديده لاحقا. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوضيح الآلية الجزيئية لعمل الأدوية أو الجزيئات الصغيرة الأخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الربط والتساهمية للبروتينات المستهدفة تحدث داخل البيئة الخلوية الأصلية ، مما يزيل خطر تعطيل بنية البروتين الأصلي وظروف الارتباط عند تحلل الخلية.

ابدأ هذا الإجراء ، عن طريق إعداد أطباق زراعة الخلايا المعقمة بحجم ستة سنتيمترات ، لعدد العينات المطلوبة. عادة ، يتم استخدام طبق واحد من الخلايا لكل حالة علاجية. سيتم إعداد ثلاثة أطباق من الخلايا لهذا العرض التوضيحي ، والتحكم السلبي باستخدام DMSO فقط ، المسمى D ، وعلاج المسبار فقط ، المسمى P ، والمسبار بالإضافة إلى المنافس ، المسمى C.To كل طبق مزرعة ، إضافة 3.5 مليون HEK 293 خلية T في أربعة ملليلتر من وسط الاستزراع.

احتضان الخلايا بين عشية وضحاها. قبل علاج الخلايا ، قم بتقطيع الأدوية اللازمة مسبقا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر. بالنسبة للمعالجة المسبقة للمنافس ، أضف أربعة ميكرولترات من DMSO إلى كل من الأنبوبين ، وأربعة ميكرولترات من 10 ملليمولار منافس إلى أنبوب واحد.

لمعالجة المسبار ، أضف 16 ميكرولترا من DMSO إلى أنبوب واحد ، و 16 ميكرولترا من 15 مسبار ضوئي ميكرومولار لكل من الأنبوبين. أحضر أطباق زراعة الخلايا إلى غطاء مزرعة الخلية لإضافة الأدوية المقتبسة مسبقا. استنشق ملليلتر واحد من وسط الاستزراع من طبق معالجة المنافسة ، ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على المنافس المسبق ، وأعد تعليق الدواء في الوسط.

أضيفي الخليط المتوسط والدواء برفق إلى الطبق. بنفس الطريقة ، أضف DMSO إلى كل من طبق التحكم السلبي وطبق المسبار. أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة.

بعد 30 دقيقة ، أعد الأطباق إلى غطاء المزرعة وقم بتعتيم الأضواء. أضف DMSO المقتبس مسبقا إلى طبق التحكم السلبي ، وقم بفحصه إلى أطباق المسبار والمنافسة. أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة ساعة.

بعد ساعة ، ضع الأطباق على الثلج. اغسل الخلايا في كل طبق برفق باستخدام خمسة ملليلتر من PBS المثلج لإزالة المسبار الزائد. أعد تغطية الخلايا بأربعة ملليلتر من PBS المثلج.

ضع طبقا من الخلايا ، متمركزا على بعد ثلاثة سنتيمترات تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية فوق كيس ثلج ، لتقليل التسخين من المصباح ، وقم بإشعاعه لمدة ثلاث دقائق. انزع الطبق وضعه على الثلج. بهذه الطريقة ، قم بإشعاع جميع العينات.

بعد تشعيع جميع العينات ، قم بشفط PBS من الخلايا ، وأضف 200 ميكرولتر من PBS المثلج البارد مع مثبطات البروتياز إلى كل طبق. افصل الخلايا عن الطبق باستخدام مكشطة مطاطية ، وانقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المسبقة التسمية على الجليد. أضف SDS إلى كل عينة إلى تركيز نهائي قدره 0.4٪ Lyse الخلايا عن طريق صوتنة المعلق ل 10 نبضات ، واحتضان على الجليد لمدة دقيقة واحدة ، ثم صوتنة ل 10 نبضات أخرى.

قم بغلي العينات على كتلة حرارية مضبوطة على 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لإكمال تحلل الخلية وتشويه طبيعة جميع البروتينات. بعد قياس تركيز البروتين في كل عينة ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتطبيع تركيز البروتين إلى 2.5 ملليغرام لكل مليلتر ، عن طريق إضافة PBS PH 8.5 بالإضافة إلى 0.4٪ SDS حسب الحاجة. لبدء هذا الإجراء ، قم بنقل 40 ميكرولترا من كل محللة خلية ، محضرة في الجزء السابق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

أضف الكواشف التالية بهذا الترتيب ، 0.2 ميكرولتر من الدقيق الأزيد ، و 0.58 ميكرولتر من TCEP ، و 3.38 ميكرولتر من TBTA. دوامة للخلط. أضف 1.14 ميكرولتر من خماسي هيدرات كبريتات النحاس لبدء التفاعل.

دوامة لفترة وجيزة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت لعينة 2X SDS لإخماد التفاعل. قم بتشغيل العينات على جل SDS-PAGE ، وعندما تصل مقدمة الصبغة إلى نهاية الجل ، استمر في تشغيل الجل لمدة خمس دقائق إضافية للتأكد من خروج كل الدقيق الزائد غير المتفاعل تماما من الجل.

بعد غسل كل الدقيق الأزيد الزائد ، ضع الجل على طبق زجاجي وامسح الجل باستخدام ماسح ضوئي للجل الفلوري ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لربط علامة البيوتين ، استخدم الحد الأقصى لكمية محللات الخلية بعد تطبيع البروتين ، بحيث تكون جميع العينات من نفس الحجم. قم بتنظيف المحللات مسبقا عن طريق إضافة كل عينة إلى أنبوب جديد يحتوي على 50 ميكرولترا من حبات الستربتافيدين أغاروز عالية السعة المغسولة مسبقا.

احتضن لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية مع الدوران. بيليه الخرز بالطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد على الجليد ، وتخلص من الخرز.

لكل 500 ميكرولتر من المحللة ، أضف الكواشف التالية ، 1.38 ميكرولتر من البيوتين أزيد ، و 5.5 ميكرولتر من TCEP ، و 32.5 ميكرولتر من TBTA. دوامة للخلط. أضف 11 ميكرولترا من كبريتات النحاس خماسي هيدرات لكل 500 ميكرولتر من المحللة والدوامة لفترة وجيزة.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أضف أربعة أحجام عينة من الأسيتون ، مبردة إلى 20 درجة مئوية ، وقم بدوامة العينات ، واحتضانها طوال الليل عند 80 درجة مئوية ، لترسيب البروتينات تماما وإزالة البيوتين أزيد غير المتفاعل. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 17 ، 000 × جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية لتكبيل البروتينات المترسبة.

شفط المادة الطافية تماما ، وأضف 150 ميكرولتر من PBS PH 7.4 و 1٪ SDS لكل عينة ، وقم بإعادة حل البروتينات عن طريق الصوتنة. أضف 600 ميكرولتر من PBS إلى كل عينة ، لتخفيف تركيز SDS إلى 0.2٪ ثم أضف العينة إلى أنبوب جديد يحتوي على 30 ميكرولتر من حبات الستربتافيدين الاغاروز عالية السعة المغسولة مسبقا. احتضن لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية مع الدوران.

بعد ساعة واحدة ، قم بتكسير الخرز عن طريق الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة ثلاث دقائق. استنشق وتخلص من المادة الطافية التي تحتوي على بروتينات غير مرتبطة. أضف ملليلترا واحدا من مخزن الغسيل المؤقت إلى الخرزات ، واحتضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الدوران.

جهاز الطرد المركزي ، وتخلص من المادة الطافية ، واغسلها بمحلول غسيل مرة أخرى. بعد الغسيل النهائي ، قم بسحب مخزن الغسيل بالكامل من الخرز ، وأضف 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت للعينة 2X SDS. احتضن لمدة خمس دقائق في كتلة حرارية 95 درجة مئوية ، لتحرير البروتينات من الخرز.

الطرد المركزي الخرزات عند 13000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. قم بسحب العينة المخزن المؤقت بعناية ، الذي يحتوي على بروتينات من الخرز ، من أجل SDS-PAGE. يتضح تصور البروتينات بعد وضع العلامات بعلامة الفلورسنت من خلال هذا الجل الفلوري الممسوح ضوئيا.

نطاق البروتين المرتبط الرئيسي المحدد ، الذي يبلغ حوالي 35 كيلودالتون ، موجود فقط في ممر المسبار ، ويتنافس عليه المركب الأصلي الزائد. تم تصور نفس النطاق البالغ 35 كيلودالتون عن طريق تلطيخ الفضة بعد سحب البيوتين ، وتم تحديده لاحقا بواسطة قياس الطيف الكتلي على أنه بروتين الغشاء VDAC1. تم التحقق من هوية البروتين بشكل أكبر ، باستخدام جسم مضاد محدد ل VDAC1.

الإشارة موجودة في حارة المسبار ، وانخفضت في حارة المنافسة. بما في ذلك جزء الإدخال ، يضمن عمل الجسم المضاد ويمكن اكتشاف البروتين محل الاهتمام في المحللة. ترجع الزيادة الطفيفة في الوزن الجزيئي للعينات المنسدلة إلى المسبار المتصل بشكل متزابق.

يتم توضيح عواقب عدم تنفيذ خطوات معينة في البروتوكول بشكل صحيح. تؤدي الإزالة غير الكاملة للدقيق الأزيد الزائد إلى مسحات سوداء كبيرة في الجزء السفلي من الجل الفلوري الممسوح ضوئيا ، في حين أن التنظيف المسبق غير الكافي للمحللات و / أو غسل الخرز ، ينتج عنه جل ملطخ بالفضة مع تلطيخ عالي جدا للخلفية. من البداية إلى النهاية ، تستغرق تجربة المنسدلة من يومين إلى ثلاثة أيام حتى تكتمل.

بعد عزل البروتين المستهدف وتحديده عن طريق قياس الطيف الكتلي أو النشاف الغربي ، يجب إجراء المزيد من تجارب التحقق من الصحة المحددة للهدف لتقييم أهمية الهدف للنمط الظاهري الناجم عن الدواء.