تحديد البروتينات ملزمة جزيء صغير في الخلوي البيئة الأصلية التي تعيش خلية Photoaffinity وصفها

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد البروتينات الرابطة للجزيئات الصغيرة باستخدام مسبار التقارب الضوئي، والذي يمكنه الارتباط بهدفه داخل الخلايا الحية، مما يسمح بعزل الهدف وتحديده لاحقاً. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوضيح الآلية الجزيئية لعمل الأدوية أو الجزيئات الصغيرة الأخرى. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن عملية الارتباط والوسم التساهمي للبروتينات المستهدفة تحدث داخل البيئة الخلوية الطبيعية، مما يزيل خطر تعطيل البنية الأصلية للبروتين وظروف الارتباط عند تحلل الخلايا.

ابدأ هذا الإجراء بتجهيز أطباق زراعة خلايا معقمة بحجم ستة سنتيمترات، حسب عدد العينات المطلوبة. وعادةً ما يُستخدم طبق واحد من الخلايا لكل حالة علاجية. سيتم تجهيز ثلاثة أطباق من الخلايا لهذا العرض التوضيحي: التحكم السلبي باستخدام DMSO فقط، ويُرمز له بالرمز D، وعلاج المسبار فقط، ويُرمز له بالرمز P، والمسبار بالإضافة إلى المنافس، ويُرمز له بالرمز C. أضف إلى كل طبق زراعة 3.5 million من خلايا HEK 293 T في أربعة milliliters من وسط الزراعة.

قم بتحضين الخلايا طوال الليل. وقبل معالجة الخلايا، قم بتوزيع العقاقير المطلوبة مسبقاً في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 milliliter. وبالنسبة للمعالجة المسبقة بالمنافس، أضف أربعة microliters من DMSO إلى كل أنبوب من أنبوبين، وأربعة microliters من المنافس بتركيز 10 millimolar إلى أنبوب واحد.

بالنسبة للمعالجة بالمجس، أضف 16 µL من DMSO إلى أنبوب واحد، و 16 µL من مجس التقارب الضوئي بتركيز 15 µM إلى كل من أنبوبين. انقل أطباق زراعة الخلايا إلى غطاء زراعة الخلايا لإضافة العقاقير الموزعة مسبقاً. اسحب 1 ml من وسط الزراعة من طبق معالجة التنافس، وانقله إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على المنافس الموزع مسبقاً، ثم أعد تعليق العقار في الوسط.

أضف خليط الوسط والعقار تدريجياً وببطء على شكل قطرات إلى الطبق. وبذات الطريقة، أضف DMSO إلى كل من طبق الضابط السلبي وطبق المسبار. ثم أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة.

بعد مرور 30 دقيقة، أعد الأطباق إلى غطاء المزارع الخلوية وقم بتعتيم الإضاءة. أضف كمية DMSO الموزعة مسبقاً إلى طبق المجموعة الضابطة السالبة، والمسبار (probe) إلى أطباق المسبار والمنافسة. ثم أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة.

بعد مرور ساعة واحدة، ضع الأطباق على الثلج. اغسل الخلايا في كل طبق برفق باستخدام خمسة مليليترات من PBS البارد جداً لإزالة المسبار الزائد. غطِّ الخلايا مرة أخرى بأربعة مليليترات من PBS البارد جداً.

ضع طبق الخلايا في مركز المسافة التي تبعد ثلاثة سنتيمترات أسفل مصباح الأشعة فوق البنفسجية (UV lamp) فوق حزمة ثلج، وذلك لتقليل التسخين الناتج عن المصباح، ثم قم بالتشعيع لمدة ثلاث دقائق. ارفع الطبق وضعه على الثلج. كرر هذه العملية لتشعيع جميع العينات.

بعد تشعيع جميع العينات، يتم سحب محلول PBS من الخلايا، وإضافة 200 µL من محلول PBS المبرد على الثلج والمحتوي على مثبطات البروتياز إلى كل طبق. تُفصل الخلايا عن الطبق باستخدام مكشطة مطاطية، وتُنقل إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة مُصنفة مسبقاً وموضوعة على الثلج. يُضاف SDS إلى كل عينة حتى يصل التركيز النهائي إلى 0.4%. يتم تحلل الخلايا عن طريق تعريض المعلق للموجات فوق الصوتية لمدة 10 نبضات، ثم تحضينه على الثلج لمدة دقيقة واحدة، ثم تعريضه للموجات فوق الصوتية لمدة 10 نبضات أخرى.

اغلِ العينات على كتلة تسخين مضبوطة عند 95 °C لمدة خمس دقائق لإتمام تحلل الخلايا ومسخ جميع البروتينات. بعد قياس تركيز البروتين في كل عينة، كما هو موضح في البروتوكول النصي، قم بتوحيد تركيز البروتين ليصبح 2.5 mg/mL، وذلك بإضافة PBS PH 8.5 بالإضافة إلى 0.4%SDS حسب الحاجة. لبدء هذا الإجراء، انقل 40 µL من كل مستخلص خلوي، تم تحضيره في الجزء السابق، إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

أضف الكواشف التالية بهذا الترتيب: 0.2 µL من flour-azide، و0.58 µL من TCEP، و3.38 µL من TBTA. استخدم جهاز Vortex للخلط. أضف 1.14 µL من كبريتات النحاس خماسية الهيدرات لبدء التفاعل.

قم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس لفترة وجيزة، ثم حضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. أضف 50 µL من منظم عينات 2X SDS لإيقاف التفاعل. قم بتشغيل العينات على هلام SDS-PAGE، وعندما تصل جبهة الصبغة إلى نهاية الهلام، استمر في تشغيل الهلام لمدة خمس دقائق إضافية لضمان خروج كل كمية زائدة من flour-azide غير المتفاعل تماماً من الهلام.

بعد غسل كل فائض من fluro-azide، ضع الهلام على لوح زجاجي وقم بمسحه باستخدام ماسح هلام فلوري، وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. أما بالنسبة لربط علامة البيوتين، فاستخدم أكبر كمية من محللات الخلايا بعد معايرة البروتين، بحيث تكون جميع العينات بنفس الحجم. قم بالتنقية المسبقة للمحللات عن طريق إضافة كل عينة إلى أنبوب جديد يحتوي على 50 microliters من حبيبات streptavidin agarose عالية السعة والمغسولة مسبقاً.

تُحضن العينة لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C مع التدوير. يتم تجميع الخرزات في القاع عن طريق الطرد المركزي. يُنقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد على الثلج، ويتم التخلص من الخرزات.

لكل 500 µL من المستخلص الخلوي، أضف الكواشف التالية: 1.38 µL من biotin-azide، و5.5 µL من TCEP، و32.5 µL من TBTA. قم بالرج باستخدام جهاز vortex للمزج. أضف 11 µL من كبريتات النحاس خماسية الهيدرات لكل 500 µL من المستخلص الخلوي وقم بالرج لفترة وجيزة باستخدام جهاز vortex.

يتم التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أضف أربعة أضعاف حجم العينة من الأسيتون المبرد إلى 20 °C، ثم قم برج العينات باستخدام جهاز الـ vortex والتحضين طوال الليل عند 80 °C، وذلك لترسيب البروتينات تماماً وإزالة البيوتين-أزيد غير المتفاعل. وفي اليوم التالي، يتم طرد العينات مركزياً عند 17,000 x g لمدة 15 دقيقة عند 4 °C لترسيب البروتينات المترسبة في شكل كريات.

قم بسحب السائل الطافي بالكامل، وأضف 150 µL من PBS PH 7.4 و1% SDS إلى كل عينة، ثم أعد إذابة البروتينات عن طريق الموجات فوق الصوتية (sonication). أضف 600 µL من PBS إلى كل عينة لتخفيف تركيز SDS إلى 0.2%، ثم أضف العينة إلى أنبوب جديد يحتوي على 30 µL من حبيبات streptavidin agarose عالية السعة والمغسولة مسبقاً. قم بالتحضين لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C مع التدوير.

بعد مرور ساعة واحدة، يتم تجميع الخرزات عن طريق الطرد المركزي عند 1000 x g لمدة ثلاث دقائق. يتم سحب المادة الطافية، التي تحتوي على البروتينات غير المرتبطة، والتخلص منها. يُضاف 1 mL من محلول الغسيل إلى الخرزات، وتُحضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التدوير.

قم بإجراء الطرد المركزي، وتخلص من السائل الطافي، ثم اغسل باستخدام محلول الغسيل مرة أخرى. بعد الغسلة النهائية، قم بشفط محلول الغسيل بالكامل من الخرزات، وأضف 30 µL من محلول SDS العيني بتركيز 2X. قم بالتحضين لمدة خمس دقائق في كتلة تسخين عند درجة حرارة 95 °C، لتحرير البروتينات من الخرزات.

قم بطرد الخرزات مركزياً بسرعة 13000 x g في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. اسحب بعناية باستخدام الماصة منظم العينة الذي يحتوي على البروتينات من فوق الخرزات، وذلك لإجراء تحليل SDS-PAGE. يظهر تصور البروتينات بعد وسمها بالوسم الفلوري في هذا الهلام الممسوح ضوئياً بالفلورية.

تظهر حزمة بروتين الارتباط النوعي الرئيسية، عند وزن جزيئي يبلغ 35 kilodaltons تقريبًا، فقط في مسار المسبار (probe lane)، ويتم تثبيطها بإضافة فائض من المركب الأصلي. وقد تم تصور حزمة 35 kilodalton ذاتها عن طريق صبغ الفضة بعد عملية سحب البيوتين (biotin pulldown)، ثم تم تحديدها لاحقًا بواسطة مطياف الكتلة على أنها بروتين الغشاء VDAC1. كما تم التحقق من هوية البروتين بشكل إضافي باستخدام جسم مضاد نوعي لـ VDAC1.

تظهر الإشارة في مسار المسبار، وتتناقص في مسار المنافسة. ويضمن تضمين جزء المدخلات (input fraction) أن الأجسام المضادة تعمل وأن البروتين المستهدف يمكن اكتشافه في المستخلص الخلوي. أما الزيادة الطفيفة في الوزن الجزيئي لعينات السحب (pulldown samples)، فتعود إلى المسبار المرتبط تساهمياً.

توضح الصور العواقب المترتبة على عدم تنفيذ بعض خطوات البروتوكول بشكل صحيح. يؤدي الإزالة غير الكاملة لـ flour-azide الزائد إلى ظهور لطخات سوداء كبيرة في أسفل الهلام الممسوح ضوئيًا بالفلورسنت، بينما يؤدي عدم كفاية التصفية المسبقة للتحللات الخلوية أو غسل الخرزات إلى ظهور هلام مصبوغ بالفضة مع تلوين خلفي مرتفع جدًا. تستغرق تجربة السحب (pulldown) من البداية إلى النهاية يومين إلى ثلاثة أيام لإكمالها.

بعد عزل البروتين المستهدف وتحديده عن طريق مطيافية الكتلة أو لطخة وسترن، يجب إجراء تجارب تحقق إضافية محددة للهدف لتقييم مدى صلة الهدف بالنمط الظاهري الناجم عن الدواء.