هضم عيون الماوس كله لتحليل Cytometric تدفق متعدد المعلمة من البلاعات أحادية النوى

يوفر هذا البروتوكول طريقة لهضم العينين بالكامل في تعليق خلية واحدة لغرض تحليل cytometric تدفق متعدد المعلمة من أجل تحديد مجموعات ب والدمغة أحادية النواة العينية المحددة، بما في ذلك أحادية الخلايا، microglia، الضامة، والخلايا المتجّنة.

تم تصميم هذا البروتوكول لهضم عيون الفأر الكاملة في معلق خلية واحدة لقياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات للخلايا البلعمية أحادية النواة والتي تشمل البلاعم والخلايا الوحيدة والخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا المتغصنة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على استخدام التحليل الكمي بكثافة الفلوروفور للتمييز بين أنواع الخلايا ذات الصلة الوثيقة باستخدام تعبير علامة سطح الخلية. تم تحسين بروتوكولنا لتحليل عدم تجانس البلاعم ، بما في ذلك كل من السكان المقيمين والمتسللين في نموذج الأوعية الدموية المشيمية الجديدة الناجم عن الليزر.

ومع ذلك ، يمكن تطبيق هذه المفاهيم والتقنيات بالتساوي على نماذج أخرى مثل اعتلال الشبكية السكري ، والتهاب القزحية المناعي الذاتي التجريبي ، بالإضافة إلى مظاهر الذئبة. عند محاولة هذا البروتوكول ، يعد فهم تكوين مقياس الخلايا نقطة انطلاق حاسمة حيث لا يتم تكوين جميع مقاييس الخلايا بنفس الطريقة بالضبط. وبالتالي ، قد تحتاج أحجام الأجسام المضادة المترافقة بالفلورسنت إلى معايرة و / أو قد تحتاج الفلوروفورات إلى التعديل لتحسين البروتوكول بناء على تكوين مقياس الخلوي.

ابدأ بإعداد المخزن المؤقت للهضم وفقا لتوجيهات المخطوطة. باستخدام مجهر تشريح وتكبير إجمالي 10X ، قم بإزالة الملتحمة والعصب البصري المتبقي من العينين. انقل العيون النظيفة إلى طبق تشريح جاف أو قارب وزن صغير ، ثم قم بعمل جرحين مثقبين بزاوية 90 درجة بينهما من خلال المحور البصري.

استخدم حقنة بإبرة قياس 30 لحقن 0.15 إلى 0.2 مل من محلول الهضم في التجويف الزجاجي لكل عين. افرم العينين بمقص زنبركي وملقط ناعم، ثم افصل أنسجة العدسة باضطراب ميكانيكي حاد لمنع انسداد أطراف الماصة في الخطوات اللاحقة. شطف الملقط والمقص مع 0.75 مل من عازلة الهضم واستبدل الطبق لكل عينة.

استخدم ماصة P1000 لنقل محتويات الطبق إلى أنبوب تفكك على الجليد ، مع الحرص على عدم فقد أي مادة. اشطف الطبق بكمية إضافية من 1.5 مل من محلول الهضم وأضفه إلى أنبوب التفكك ، مما يجعل الحجم الإجمالي يتراوح بين 3.25 و 3.5 ملليلتر. قم بفصل الأنسجة الموجودة على جهاز الفصل الإلكتروني كما هو موضح في المخطوطة النصية ، وتأكد من أن جميع الأنسجة في الجزء السفلي من أنبوب التفكك المقلوب وعلى اتصال بمخزن الهضم.

ثم احتضان أنبوب التفكك عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. كرر تفكك الأنسجة مرتين أخريين ، مع احتضان العينة عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة بين التفكك. لإيقاف التفاعل ، أضف 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للتدفق البارد وضع أنابيب العينة على الجليد.

لإنشاء معلق خلية واحدة ، قم بتصفية تفاعل هضم العين المتوقفة من خلال مرشح 40 ميكرومتر يوضع في الجزء العلوي من أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل. استخدم المكبس من حقنة سعة 2.5 مل لدفع أي قطع متبقية من أنسجة العين غير المهضومة عبر الفلتر. اغسل أنبوب التفكك ب 10 مل من عازلة التدفق واشطف الفلتر.

ثم استخدم نفس المكبس لتمرير قطع أنسجة العين غير المهضومة مرة أخرى عبر الفلتر. كرر هذه العملية بخمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للتدفق. ثم اغسل أنبوب التفكك والفلتر بمحلول 10 مل نهائي من التدفق المؤقت.

الطرد المركزي للأنبوب المخروطي عند 400 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وصب المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. قم بتفتيت الحبيبات عن طريق تحريك الأنبوب على أنبوب آخر. ثم أضف ملليلترا واحدا من محلول التحلل وقم بتدوير الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية لتحلل خلايا الدم الحمراء.

أوقف التفاعل ب 20 مل من المخزن المؤقت للتدفق والطرد المركزي للأنبوب المخروطي عند 400 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. صب المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. انقر فوق الأنبوب على أنبوب آخر.

ثم أضف خمسة ملليلتر من HBSS البارد. كرر الطرد المركزي وقم بإزالة المادة الطافية. أضف 0.5 مل من البقعة الحية الميتة إلى كل عينة باستخدام ماصة P1000 ، مع التأكد من فصل الحبيبات تماما.

انقل العينات إلى أنابيب ميكروتيتر سعة 1.2 ملليلتر واحتضانها لمدة 15 دقيقة في الظلام. في هذه الأثناء ، احسب كمية 10 ميكرولتر من العينة باستخدام التريبان الأزرق ومقياس كثافة الدم. بعد الحضانة ، اغسل كل عينة بإضافة 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق البارد.

بالطرد المركزي للأنابيب في رف أنبوب ميكروتيتر عند 400 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وشفط المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. أعد تعليق الخلايا تماما في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق البارد. ثم كرر الطرد المركزي وقم بإزالة المادة الطافية.

حجب ما يصل إلى خمسة ملايين خلية حية في 50 ميكرولترا من كتلة FC. قم بفصل حبيبات الخلية تماما واحتضانها عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم أضف 50 ميكرولترا من محلول تلطيخ الأجسام المضادة لكل عينة.

اخلطيها تماما واحتضنيها لمدة 30 دقيقة أخرى عند أربع درجات مئوية. يتم عرض خصائص منطقة التشتت الأمامية مقابل منطقة التشتت الجانبية لجميع الأحداث التي تم تحليلها من عينين لماوس واحد. تم تنظيف عدد الخرز وتأكيده من خلال تخطيط PE على APC-Cy7 ، مما أدى إلى إنشاء مجموعة ضيقة من الأحداث الإيجابية PE و APC-Cy7 السلبية.

بعد ذلك ، تم تحديد المفردات في الخلايا الحية من جميع الأحداث. كانت المفردات مرتبطة بشكل إيجابي في ارتفاع الانتثار الأمامي مقابل منطقة التشتت الأمامية بينما كان للخلايا المزدوجة والثلاثية مساحة تشتت أمامية أكبر من ارتفاع الانتثار الأمامي. الخلايا الحية هي منطقة التشتت الأمامية إيجابية والبقعة الميتة الحية سلبية.

عرض استراتيجية البوابات الأولية لتحديد الخلايا البلعمية أحادية النواة من الخلايا المفردة الحية هنا. تم تصور المفردات الحية باستخدام مخطط CD45 مقابل CD11b. أكد عدم وجود خلايا إيجابية CD45 في CD45 FMO اختيار البوابة.

بعد ذلك ، تم استبعاد العدلات ، واليوزينيات ، والخلايا البائية ، والخلايا K ، والخلايا التائية عن طريق رسم المفردات الحية الإيجابية CD45 مع بوابة النسب مقابل CD11b. تم تمييز خلايا CD45-dim عن الخلايا العالية CD45. كما تم تحديد مجموعات فرعية من البلاعم.

تم تحديد الخلايا الدبقية الصغيرة في خلايا CD45-الخافتة مع تلطيخ منخفض معقد معقد التوافق النسيجي الكبير الإيجابي CD64. تم تحديد البلاعم السلبية ل MHC2 على أنها إيجابية CD64 معقد التوافق النسيجي النسيجي الكبير2. تم إثبات البلاعم CD11c السلبية و CD11c الإيجابية على أنها CD64 إيجابية CD11c سلبية.

و CD64 إيجابي CD11c إيجابي في الخلايا الإيجابية MHC2. وجد أن العلاج بالليزر زاد من كمية الضامة الإيجابية ل MHC2 و CD11c السلبية و CD11c. كما تم تنظيم عدد الخلايا المتغصنة عن طريق العلاج بالليزر بينما لم يتأثر عدد الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الوحيدة.

يكن للتروية الجهازية أي تأثير على أعداد البلاعم. باتباع هذا الإجراء ، يسمح فرز الخلايا المنشطة بالفلور بدلا من التحليل وحده بتوصيف عدم تجانس البلاعم وتأثيره على الوظيفة من خلال الدراسات النسخية أو البروتينية.