البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

الهدف العام من بروتوكول التقاط التقارب هذا هو عزل مجمعات البروتين الذاتية من خلايا الثدييات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البيولوجيا الخلوية والجزيئية ، مثل البروتينات التي تتشكل معا في وحدات وظيفية مرتبطة فيزيائيا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن ملاحظة العديد من التفاعلات الجسدية المرتبطة بالبروتين المستهدف محل الاهتمام في وقت واحد.

قم بزراعة جرام إلى ثمانية جرامات من الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص. اسكب وسط النمو في دورق كبير. ثم ضع طبق الثقافة على الثلج في وعاء جليدي مستطيل كبير.

أضف 20 مل من محلول ملحي 1x مخزن بالفوسفات ، أو PBS ، إلى طبق الاستزراع وحرر الخلايا من الطبق باستخدام مكشطة خلية كبيرة. انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 50 مليلتر مبرد مسبقا على الثلج. أضف 10 مل إضافية من 1x PBS المثلج إلى نفس الطبق.

اجمع الخلايا المتبقية وانقلها إلى أنبوب 50 ملليلتر. كرر هذه العملية لكل طبق. يمكن الجمع بين معلقات الخلايا من أطباق مختلفة لتقليل عدد العينة والنفايات البلاستيكية.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات لمدة خمس دقائق عند 1,000 × جم في أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، اسكب بعناية المادة الطافية. أعد تعليق كل بيليه في عشرة ملليلتر من 1x PBS المثلج.

توحيد الكريات المعلقة في ما يصل إلى خمسة لكل 50 أنبوب ملليلتر. اغسل الأنابيب الفارغة ب 10 ملليلتر من PBS. أضف المحلول إلى العينات المجمعة وأجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل.

بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من 1x PBS المثلج. قم بإزالة المكبس من حقنة سعة 20 مليلتر واتركه جانبا. قم بتغطية فوهة المحقنة ، ضع المحقنة داخل أنبوب سعة 50 مليلتر ، وانقل تعليق الخلية هناك.

جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 1000 × جم ، أربع درجات مئوية. قم بشفط المادة الطافية بماصة رفيعة الرؤوس متصلة بنظام مصيدة مفرغة حتى تبدأ الطبقة العليا من الخلايا في الامتصاص. ينتج عن هذا بيليه خلية رطبة.

قم بفك غطاء المحقنة ، وأدخل المكبس وقم بتقطير الخلايا مباشرة في دورق بلاستيكي كبير مملوء بالنيتروجين السائل موجود في حمام نيتروجين سائل في صندوق من الستايروفوم. اغمر الخلايا المتبقية بالقوة من المحقنة. بعد ذلك ، صب الخلايا المجمدة في أنابيب 50 ملليلتر.

قم بتغطية الأنابيب بشكل غير محكم للسماح للنيتروجين السائل الزائد بالتبخر. احتفظ بها طوال الليل عند 80 درجة مئوية. شد الأغطية بالكامل في اليوم التالي.

يمكن تخزين الخلايا المجمدة بهذه الطريقة عند 80 درجة مئوية حتى الطحن بالتبريد. قم بإزالة حبات الخلية من الفريزر 80 درجة مئوية وضعها في حامل أنبوب سعة 50 مليلتر في حمام نيتروجين سائل. قم بتبريد وعاء سعة 50 مليلتر ، وكرتين بحجم 20 ملم ، وغطاء البرطمان في دلو ثلج مستطيل نظيف يحتوي على النيتروجين السائل.

أيضا ، قم بتبريد عازل PTFE مسبقا. استخدم إما مجموعة من كرات الصولجان أو كم وعفريت. قم بتعيين الموازنة المناسبة على المطحنة.

باستخدام الملقط ، ضع كرتي الطحن المبردتين مسبقا مقاس 20 ملم والخلايا المجمدة داخل جرة الطحن المبردة مسبقا. أضف النيتروجين السائل إلى البرطمان حتى نصفها ممتلئا ، ثم ضع الغطاء على البرطمان وانقل المجموعة إلى المطحنة. قم بتثبيت التجميع في مكانه وقم بإجراء ثلاث دورات من الطحن ، باستخدام برنامج 400 دورة في الدقيقة ، وثلاث دقائق ، ودوران عكسي كل دقيقة ، وبدون فاصل فاصل.

من الأهمية بمكان سماع قعقعة الكرات أثناء الطحن ، فهذا يشير إلى أن الكرات تصطدم وتسحق المادة. عدم سماع هذا الصوت يعني أن الطحن لا يحدث. عند الانتهاء من ثلاث دورات طحن ، انقل البرطمان مرة أخرى إلى النيتروجين السائل واتركه يرتاح للحظات ليبرد.

قم بإزالة الغطاء بعناية. قم بإزالة الكرات باستخدام الملقط وانقل المسحوق إلى أنبوب 50 مليلتر مبرد مسبقا باستخدام ملعقة مبردة مسبقا. لاحظ أن إضافة النيتروجين السائل إلى البرطمان يمكن أن يساعد في إزاحة المسحوق المتكتل على الكرات.

لتحضير مستخلص الخلية, وزن 100 ملليغرام من مسحوق الخلية في 1.5 أو اثنين من أنبوب ميكروفيج المبرد مسبقا. قم بتوازن تحليلي مع أنبوب الطرد الدقيق الفارغ. قم بتوزيع مسحوق الخلية في الأنبوب باستخدام ملعقة أو ملعقة مبردة بالنيتروجين السائل.

تحقق من كتلة المسحوق الذي يتم توزيعه داخل الأنبوب على الميزان التحليلي قبل إعادة الأنبوب إلى النيتروجين السائل. افتح الأنبوب بمسحوق الخلية واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة لتحرير الضغط داخل الأنبوب ومنع التجميد الفوري للمخزن المؤقت للاستخراج عند إضافته إلى المسحوق. أضف 400 ميكرولتر من المستخرج ، مع استكمال مثبطات البروتياز إلى الأنبوب.

دوامة الأنبوب لفترة وجيزة ثم امسك على الجليد. استخدم جهاز الموجات فوق الصوتية ذو الطرف الصغير لإعطاء العينة نبضة قصيرة منخفضة الطاقة وتفريق أي مجاميع. توضيح المستخلص عن طريق الطرد المركزي.

أخيرا ، قم بإزالة المادة الطافية وانتقل إلى التقاط التقارب. لغسل وسط التقارب مسبقا ، ضع الأنابيب التي تحتوي على حبات مغناطيسية مقترنة بالأجسام المضادة على المغناطيس. سوف تتراكم الخرزات على جانب الأنبوب في غضون ثوان ، مما يسمح بإزالة محلول التخزين.

ثم أضف 500 ميكرولتر من مخزن الاستخراج إلى الخرز. دوامة لفترة وجيزة بسرعة متوسطة للخلط. يقوم Pluse بتدوير الأنابيب في جهاز طرد مركزي صغير لجمع جميع المحتويات في قاع الأنبوب.

ثم ضع الأنابيب على المغناطيس واستنشق المحلول. ابدأ التقاط التقارب عن طريق نقل مستخلص الخلية المصفاة إلى الأنابيب التي تحتوي على وسط تقارب ودوامة مغسولة مسبقا لفترة وجيزة. احتضن الأنابيب لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع خلط لطيف مستمر على عجلة مدورة.

يجب أن تظل الخرزات معلقة طوال فترة الحضانة. استنشق المادة الطافية واغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من المخزن المؤقت للاستخراج البارد. لإزالة البروتينات ، أضف المخزن المؤقت لعينة صفحة SDS دون عامل الاختزال ، للتخفيف من إطلاق سلاسل الأجسام المضادة من الخرز.

احتضن لمدة خمس إلى عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التحريض. اجمع المادة الطافية واحفظها ، ثم أخضع العينات إلى صفحة SDS ، متبوعا بتلوين البروتين باستخدام التقنيات القياسية. يمكن استئصال نطاقات البروتين الفردية لتحديد الهوية ، أو يمكن وصف العينة بأكملها في تحليل واحد عن طريق الكهربية للعينة لفترة وجيزة فقط.

يمكن أن تؤثر المادة التي تشتمل على الوسط غير القابل للذوبان المستخدم في التقاط التقارب على البروتين المسترد. تظهر هنا الخرز المغناطيسي ، والأغاروز المشبع بالحديد ، والأغاروز التقليدي. تم إقران كل وسيط بالأجسام المضادة ل FLAG M2 ، واستخدم لالتقاط الفوسفاتيز القلوي البكتيري الموسوم بعلامة FLAG في مستخلصات منتجة من خلايا HEK 293 المطحونة بالتبريد.

أظهرت الخرزات المغناطيسية على نطاق ميكرون أنظف ملف تعريف ، مما يشير إلى مستوى منخفض نسبيا من امتصاص البروتين غير المحدد. يمكن أن تؤثر طريقة تحلل الخلية أيضا على البروتين المسترد. هنا ، تعرض مركب بروتين داخلي لالتقاط التقارب من مستخلصات الخلايا المجمدة أو الموبضة.

لوحظ عدد أقل من الملوثات عالية الكتلة عندما تم إنتاج مستخلص الخلية من مسحوق الخلية المطحون بالتبريد. على الرغم من أن الوسائط المغناطيسية قد تظهر خلفية أقل من الوسائط الأخرى ، إلا أن الجسم المضاد نفسه قد يسهل امتصاص التلوث الإيجابي الكاذب ، خاصة في حالة عدم وجود مستضد مستهدف. لتحديد ارتباط الخلفية الذي يساهم به الوسط المغناطيسي المضاد ل FLAG عندما تكون مظلات الأجسام المضادة مشغولة أو غير مشغولة ، تم إجراء تجارب التقاط التقارب الوهمية باستخدام مستخلصات خلايا HEK 293T في وجود أو عدم وجود 3x FLAG peptide spike-in.

في حالة عدم وجود حاتمة مماثلة لها ، يلتقط وسط alpha FLAG مستوى يمكن اكتشافه من بروتينات الخلفية التي يمكن مراوغتها بشكل تنافسي باستخدام ببتيد 3x FLAG ويتم مراوغتها إلى حد كبير بواسطة المخزن المؤقت لعينة صفحة SDS. لوحظ وجود أنواع ملوثة سائدة تتراوح بين 37 و 50 كيلو دالتون. في وجود حاتمة منافسة ، فإن كل من 3x FLAG و SDS القائمين على الخروج خاليان نسبيا من ارتباط البروتين في الخلفية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم العمل بعناية وسرعة ودقة. تتبع إجراءاتك وأي اختلافات لوحظت ، لمعرفة الخطوات الأكثر أهمية لنتائجك. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس الطيف الكتلي ، والطرد المركزي لمعدل المنطقة ، والفحص المجهري الإلكتروني لتحليل تكوين الخليط ، ومستوى تجانسه ، وحجم وشكل المجمعات الجزيئية المكونة.

بعد تطويره ، مهد التقاط التقارب الطريق للباحثين في مجال البروتينات لاستكشاف تركيبات مجمعات البروتين الفسيولوجية بتفاصيل لا مثيل لها ، والتي لا تزال جهدا بحثيا عالميا مستمرا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير خلايا الثدي للطحن بالتبريد ، وكيفية تنفيذ التقاط التقارب لبروتين ذي أهمية.